雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺，其特征在于，工艺的步骤如下：固体斜面培养：将雷丸菌接种到配制的斜面培养基上培养，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；摇床种子培养：将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中培养，得到雷丸菌液体种子；雷丸菌液体深层通气发酵培养：将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中发酵，得到雷丸菌丝。本发明专利技术的培养基营养成分配比合理，能够保证雷丸菌的生长需要，整个分批发酵过程中只需一次配料、一次灭菌即可，省时、省工，又减少了由于中途加料造成染菌的机会；适合于雷丸菌大规模生产的发酵培养工艺，对于该菌以后的工业化生产有很大的指导意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物工程
，涉及一种雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺。
技术介绍
雷丸分布于我国浙江、安徽、福建、河南、河北、江苏、广西、云南、贵州、湖南、四川、甘肃、陕西等地，其菌核生长于发黄且开花的老竹根上或老竹兜下面，有时生于棕榈、桐树上或某些朽树上。杀虫消积除热的功效。大量研究表明，雷丸是一具有多重作用的药用真菌。雷丸蛋白酶有多种驱虫作用，对绦虫、蛔虫、阴道毛滴虫、蛲虫、钩虫等多种寄生虫病均有显著疗效；雷丸多糖可调节机体免疫功能，有的还有一定抗癌性；雷丸凝集素具凝血活性。由于野生资源的匮乏和生长环境的恶化，许多名贵药用真菌濒临灭绝，如何挽救这些宝贵的药用资源、满足药物开发需要显得尤为重要，利用微生物技术分离筛选出活性菌株，采用现代发酵技术进行大规模的药材生产很有必要。加上雷丸生长于竹根下，采集十分困难，故发酵培养雷丸菌药物有广泛的应用前景，其工业化生产不受季节限制，并可缩短生产周期，产品的数量及质量也易于保证和控制。上个世纪中后期发展起来的现代发酵技术已成功应用于多种药用真菌的大规模生产，其中以液体发酵技术最为成熟。本专利技术是适合于雷丸菌工业化生产的发酵培养工艺，该专利技术将液体发酵技术应用到雷丸菌菌丝的大规模生产在国内尚属首例，研究结果表明该方案是可行的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺。工艺的步骤如下1)固体斜面培养将雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)接种到配制的斜面培养基上，温度20～30℃，培养160～240小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；2)摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在20～30℃培养，转速150～200rpm，培养62～96小时，得到雷丸菌液体种子；3)雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为5～15％，罐温20～30℃、罐压0.4～1.0kg/cm，搅拌速率100～250rpm，通气量1∶0.3～1∶1.2，发酵时间100～200小时，得到雷丸菌丝。所述的斜面培养基以每1000毫升计，马铃薯100～300克、葡萄糖或蔗糖10～30克、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、维生素B1微量和琼脂15～25克。具体制备方法为取新鲜去皮马铃薯100～300克，切成0.5立方厘米左右的立方块，立即用水冲洗，用1000毫升蒸馏水煮沸20min，纱布过滤，取滤液加15～25克琼脂、10～30克葡萄糖或蔗糖、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、维生素B1微量加热溶解，加水定容至1000毫升，灭菌后即为斜面培养基。种子培养基以每1000毫升计，葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米浆40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，pH4.0～7.0。具体制备方法为取葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米浆40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，将各组分混合溶解，加水定容至1000毫升，调pH至4.0～7.0，灭菌后即为种子培养基。发酵培养基以每1000毫升计，葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米浆50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，培养基的pH值为4.0～7.0。具体制备方法为取葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米浆50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO4～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，将上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敌做消泡剂，调pH到4.0～7.0，灭菌后即为发酵培养基。本专利技术的有益效果(1)本专利技术中种子培养基提供了菌丝短期内快速生长所需的营养物质，培养72小时左右即可进行深层发酵；(2)本专利技术中液体深层通气发酵培养基，营养成分配比合理，能够保证雷丸菌的生长需要，培养基材料丰富，整个分批发酵过程中只需一次配料、一次灭菌即可，具有省时、省工，又减少了由于中途加料造成染菌的机会； (3)采用本专利技术中的液体深层通气发酵工艺进行分批发酵，每升发酵液可得到10～15克的干菌丝；(4)本专利技术是适合于雷丸菌大规模生产的发酵培养工艺，对于该菌以后的工业化生产有很大的指导意义。具体实施例方式雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.AS 5.158，属于担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，多孔菌属。所述的生产雷丸菌丝的工艺是从野生雷丸菌核上分离纯化得到的纯菌株，依次经固体斜面培养、摇床种子培养和发酵培养完成。菌株的18S核糖体DNA(18S rDNA)部分序列(NCBI登录号AY944218)如下TTTTTCCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCTTGTGAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATACCTAGTAAGCGTGAGTCATCAGCTCGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTTGGGATTGGCTTCGGGGAGCCGGCAACGGCACCCTGTTGCTGAGAACTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA。本专利技术的放罐标准是发酵液变得粘稠，镜检发现菌丝开始老化。下面结合具体实施例来进一步详细描述本专利技术。实施例11)固体斜面培养将雷丸菌接种到配制的斜面培养基上，温度20℃，培养160小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；所述的斜面培养基以每1000毫升计，马铃薯100克、葡萄糖10克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O 1克、维生素B1微量和琼脂15克。2)摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在20℃培养，转速150rpm，培养62小时，得到雷丸菌液体种子；所述的种子培养基以每1000毫升计，葡萄糖10克、蔗糖10克、玉米浆40毫升、酵母粉10克、KH2PO41克、MgSO4·7H2O 0.2克、维生素B10.01克，pH4.0。3)雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为5％，罐温20℃、罐压0.4kg/cm，搅拌速率100rpm，通气量1∶0.3，发酵时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺，其特征在于，工艺的步骤如下：１）固体斜面培养将雷丸菌（Ｌａｃｃｏｃｅｐｈａｌｕｍｍｙｌｉｔｔａｅ，ｆｏｒｍｅｒｌｙｃａｌｌｅｄＰｏｌｙｐｏｒｕｓｍｙｌｉｔｔａｅ）接种 到配制的斜面培养基上，温度２０～３０℃，培养１６０～２４０小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；２）摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在２０～３０℃培养，转速１５０～２００ｒｐｍ，培养 ６２～９６小时，得到雷丸菌液体种子；３）雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为５～１５％，罐温２０～３０℃、罐压０．４～１．０ｋｇ／ｃｍ，搅拌速率１００～２５０ｒｐｍ ，通气量１∶０．３～１∶１．２，发酵时间１００～２００小时，得到雷丸菌丝。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李永泉，周立华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]