一种双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＢＥＳ、双歧杆菌－ＥＴＥＣ　ＣＦＡ／Ｉ重组载体及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＢＥＳ以及由其构建的双歧杆菌－ＥＴＥＣＣＦＡ／Ｉ重组载体、双歧杆菌－ＥＴＥＣＣＦＡ／Ｉ重组载体口服活疫苗及其用途。所述的ｐＢＥＳ载体是由ＧｅｎＢａｎｋ号为Ｕ１３８５６的ｐＧＥＸ－５ｘ－１为骨架改造而来；所述的双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＢＥＳ用于以双歧杆菌为受体菌的所有外源基因的表达。用上述双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＢＥＳ构建的双歧杆菌－ＥＴＥＣＣＦＡ／Ｉ重组载体；所述的ＥＴＥＣ　ＣＦＡ／Ｉ为人的ＥＴＥＣ　　ＣＦＡ／Ｉ。上述双歧杆菌－ＥＴＥＣ　　ＣＦＡ／Ｉ重组载体构建的口服活疫苗；上述双歧杆菌－ＥＴＥＣ　　ＣＦＡ／Ｉ重组载体口服活疫苗的应用，用于预防和治疗ＥＴＥＣ引发腹泻性疾病。本发明专利技术可以通过基因工程手段让双歧杆菌替代传统的ＥＴＥＣ疫苗中ＣＦＡ／Ｉ的受体菌，既解决了活疫苗构建的载体系统的安全性问题，又发挥了双歧杆菌抑制肠道病原菌的微生态效应。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＢＥＳ，其特征在于所述的ｐＢＥＳ载体是由ＧｅｎＢａｎｋ号为Ｕ１３８５６的ｐＧＥＸ－５ｘ－１为骨架改造而来；该载体的构建步骤如下：第一步，用卡那霉素抗性基因替换ｐＧＥＸ－５ｘ－１质粒１３４４－２２２０ｎｔ的Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ抗性基因的序列区，即（ａ）先用ＰＣＲ方法从ＧｅｎＢａｎｋ号为ＥＵ２３３６２３的质粒ｐＥＡＳＹ－Ｔ１上扩增１２０３－２１１４ｎｔ片段，得到卡那霉素抗性基因，正向ＰＣＲ引物为：ａｇｔａｇａｃｇｔｃｃｔｇｇｔａａｇｇｔｔｇｇｇａａｇ，位置在１２０３－１２１９ｎｔ，５’端添加ＡａｔⅡ酶切位点，反向引物为：ａｃｇｔｃａｇｔｇｇｃｔｇｃａａｔｔｃａｇａａｇ　ａａｃｔｃｇｔｃ，位置在２１１４－２０８５ｎｔ，５’端添加ＡｌｗＮ１酶切位点：ＰＣＲ扩增条件为：９５℃４ｍｉｎ，经９５℃４０Ｓｅｃ、５５℃３０Ｓｅｃ、７２℃１ｍｉｎ循环扩增２５次；（ｂ）将上述ＰＣＲ纯化产物和ｐＧＥＸ－５ｘ－１质粒分别用ＡａｔⅡ和ＡｌｗＮ１双酶切，回收酶切后的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＸ－５ｘ－１大片段按１∶２混合连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，挑取在卡那霉素抗性平板上生长阳性单克隆，再一次在卡那霉素抗性平板上划线纯化，同时在青霉素平板上划线培养而不能生长的单菌落一定是阳性菌落，然后测序确认；第二步，以第一步所得到阳性菌落中的质粒为模板，用高保真ＴａｑＤＮＡ聚合酶通过ＰＣＲ扩增，以四环素ｔｅｔＯ启动子替换ｐＧＥＸ－５ｘ－１质粒１８３－９３２上的Ｐｔａｃ启动子，同时删除ｐＧＥＸ－５ｘ－１质粒上３３０１－４４２０ｎｔ的ＬａｃＩｑ片段，引物ｐＦ１为ｐＧＥＸ－５ｘ－１上的多克隆位点序列，ｐＲ１为ＬａｃＩｑ上游序列，引物序列如下：ｐＦ１：ａｔｔａｇｇａｔｃｃｃｃｇａａｔｔｃｃｃｇ，５’端添加ＢａｍＨＩ酶切位点；ｐＲ１：ｔｃｇａｃｃｇｃｇｇａｔｔｃａｃｃａｃｃｃｔｇａａｔｔｇａｃ，５’端添加ＳａｃⅡ酶切位点，ＰＣＲ扩增条件为：９５℃４ｍｉｎ，经９５℃４０Ｓｅｃ、５２℃３０Ｓｅｃ、７２℃１ｍｉｎ循环扩增３０次，ＰＣＲ产物用ＢａｍＨＩ和ＳａｃⅡ双酶切备用；同时，用ＢａｍＨＩ和ＳａｃⅡ酶切切取由上海生物工程技术公司合成的ｔｅｔＯ启动子序列，其序列如下：ｔｃｇａｃｃｇｃｇｇａｃｔｇｇｃｃｇｔｃｇｔｔｔｔａｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｔｔｇａｃａｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马永平，宋方洲，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]