一种基于超支化聚合物的酶固定化方法技术

本发明专利技术涉及一种基于超支化聚合物的酶固定化方法，该方法属于生物工程技术领域，该方法包括：在合成好的外围带有大量重氮盐基团的超支化聚合物溶液中，或在将该超支化聚合物溶液用水或有机溶剂Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺稀释１００倍以下的稀释溶液中，将载体浸泡半个小时以上；然后将载体取出，用水清洗，再将其浸入含酶的缓冲溶液中，在４℃以下吸附４小时以上，以达到饱和吸附；本方法能够大大简化固定化酶的操作步骤，无须对材料和酶进行前期修饰，普适性很高；能够用于多种酶和载体上，并对酶的催化活性没有明显影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，特别涉及在各种聚合物薄膜上以及无机材料上固定酶以及其它生物活性成分的方法。技术背景 随着生物技术的飞速发展，生物工程作为技术革命的前沿领域，在工业，农业，医 药方面得到了广泛的应用，对解决当今人类所面临的许多问题如资源，能源，环保等起着举 足轻重的作用。 作为生物工程的组成部分之一，酶工程已经广泛的应用于工业生产中的食品，纺织等部门，但是由于天然酶稳定性低，对高温、有机溶剂极为敏感，容易失活，且无法重复利用，催化反应后酶混合在产品中，使其难以纯化，从而限制了它的应用。酶的固定化技术就是为了解决这一问题而发展起来的。酶的固定化技术是指利用一定的材料将活性酶束缚在某一区域内，但是保留酶的催化活性，并能实现酶的回收利用的一种新技术。与游离酶相比，固定化酶利于回收，从而消除了酶对产物的污染，降低了酶的使用成本。利用固定化技术能够大大提高酶的储存以及操作稳定性，从而延长了酶的使用寿命，在非水介质中，固定化技术能够有效的减小有机溶剂对酶的影响，另外利用固定化技术还能实现多重酶对话。 常用的酶的固定化方法有如下几种1)非共价结合法，又可分为结晶法，分散法，物理吸附法，离子结合法，这种方法的特点是操作简单，但是非共价法所利用的作用力比较弱，在工业生产中的高浓度及高离子强度下，固定化酶容易脱落。2)包埋法，又可分为微囊法，网格法，这种方法的特点是利用溶胶凝胶法，多孔纤维或微胶囊将酶束缚在载体上，通过物理或化学作用力使其稳定，通常要求在合成聚合物网状结构的同时加入酶，这种方法的缺点是对材料要求比较特殊，普适性不强。3)化学结合法，又可分为交联法，共价结合法，这类方法能够有效的克服非共价结合法的缺点，提高酶的操作稳定性，缺点是利用共价法固定酶需要经过几步反应，例如先对固定化材料进行表面修饰，使其带上能与酶发生化学反应的官能团，然后再利用酶与官能团之间化学反应将酶固定到材料表面，对于不同的材料，由于其表面性质不同，需要采用不同的官能团来修饰，所以步骤比较烦琐，且在固定化过程中会降低酶的催化活性。 由上可见，各种固定化酶的方法都有各自的局限性，尤其是随着生物工程的发展， 要求将酶固定在各种材料如高分子膜表面来制备性能良好的器件，然而高分子材料表面具 有一定的疏水性，普通生物分子很难吸附到其表面，虽然有一些方法如通过在基材表面修 饰，再固定化酶(中国专利，公开号CN86100565)，这种方法只对某些材料适用，还有通过利 用中介聚合物将酶和材料连接在一起(中国专利，公开号CN1358856)，这种方法要求材料 表面带负电荷，而且要在pH高于酶等电点的溶液里吸附酶，都有比较大的局限性。 王晓工等人在Chem Lett 2004， 33 :22-33中介绍了一类新型的外围带有大量重 氮盐基团的超支化聚合物新合成方法，以典型的超支化聚合物(DAS)为例，合成路线如下 式3<formula>formula see original document page 4</formula> 首先将N， N-二羟乙基苯胺氯化反应成为N， N-二 (2-氯乙基)苯胺。然后使 N， N-二 (2-氯乙基)苯胺与4-氨基苯甲酸发生亲核取代反应制备AB2型的单体N， N-二 苯胺(AEA)。超支化聚合物如DAS采用AEA单体重氮偶合反 应縮聚制备。制备好的超支化聚合物溶液在4t:以下保存，可以稳定存放。通过改变单体上 的取代基团，可以得到不同的此类超支化聚合物的衍生物，如在单体的苯环上引入取代基 团(氰基，硝基等等)，如以下式的分子a，分子b作为单体可以分别得到类似的超支化聚合 物DAS-1， DAS-2，同样DAS-1， DAS-2在4°C以下保存，也可以稳定存放。<formula>formula see original document page 4</formula>
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服已有技术的不足之处，提出一种基于超支化聚合物的酶固定化方法。本方法能够大大简化固定化酶的操作步骤，无须对材料和酶进行前期修饰，普适性很高；能够用于多种酶和载体上，并对酶的催化活性没有明显影响。 本专利技术提出，其特征在于，包括以下步 骤 1)在合成好的外围带有大量重氮盐基团的超支化聚合物溶液中，或在将该超支 化聚合物溶液用水或有机溶剂N， N- 二甲基甲酰胺稀释100倍以下的稀释溶液中(在低于 4°C，以保证酶不失活的条件下)，将载体浸泡半个小时以上； 2)然后将载体取出，用水清洗，再将其浸入含酶的缓冲溶液中(缓冲溶液用以保 证酶不失活)，在4°C以下吸附4小时以上，以达到饱和吸附，即完成固定化酶的过程。所述载体可包括聚乙烯，及其衍生物如聚氯乙烯，聚苯乙烯；或聚丙烯及其衍生 物；或尼龙66 ;聚甲基丙烯酸甲酯类材料；或聚碳酸酯类材料；或二氧化硅类材料；或单晶 硅中的一种材料。 所述载体材料可采用片状、管状、纤维薄膜之中任一种形状。 所述酶包括beta-葡萄糖苷酶，木瓜蛋白酶，辣根过氧化物酶之中任一种。4 上述外围带有大量重氮盐基团的超支化聚合物的合成方法采用王晓工等人在 Chem Lett 2004,33 :22-33中所设计的路线。 所述外围带有大量重氮盐基团的超支化聚合物还可包括通过改变单体上的取代 基团，得到不同的该类超支化聚合物的衍生物。 本专利技术的技术特点及效果 本专利技术的关键是采用一种外围带有大量重氮盐基团的高反应性超支化聚合物。利 用其高反应活性以及多官能团性质，，可将载体材料和酶连接在一起。由于这种超支化聚合 物具有很强的吸附性，并且自身所带的重氮盐基团能和材料表面以及酶都发生反应形成共 价键。这种方法能够大大简化固定化酶的操作步骤，无须对材料和酶进行前期修饰，普适性 很高；能够用于多种酶和载体上，并对酶的催化活性没有明显影响。 上述所采用的材料如聚乙烯、聚丙烯、硅片、石英片等本身对酶没有明显的吸附作用，当采取了用外围带有大量重氮盐基团的超支化聚合物作为酶固定化试剂，各种材料固定化酶的效率大大增加。而且，对各种不同的材料，不同的酶都有很好的效果。将酶固定到载体表面后，酶的热稳定性和pH稳定性大大增加，而且可以实现循环利用。 本专利技术方法可适用于各种形态的材料，如聚合物膜、纤维、无机晶体等等。本专利技术方法对材料的厚度以及结构没有特殊要求，可适用于无定形材料、晶体、均质膜、不对称膜、多孔膜等等。本专利技术所得到的固定化酶材料可适用于许多领域，如酶反应器、酶膜电极等等，也可以用于生物产品的合成与分离。 与以前的文献与专利中报道的方法比，本专利技术有如下优势 1)可应用材料的范围广这种方法能够将酶固定在不同性质的材料上，这种材料 可以是聚合物如聚乙烯、聚丙烯，也可以是无机材料如硅、石英等等。这种固定化方法本身 对材料的形态和性质等没有特殊的要求。 2)固定化方法简单主要是利用外围带有大量重氮盐基团的超支化聚合物的强 吸附性以及高反应性，不需要对材料和基材进行预处理，从而大大简化了操作步骤，提高了效率。 3)所得到的固定化酶材料稳定性高，可以重复利用。 4)该固定化方法可适用于各种酶的固定化，应用范围广。具体实施方式 实施例1 : 将聚乙烯薄膜裁剪成2cmX2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于超支化聚合物的酶固定化方法，其特征在于，该方法包括以下骤：１）在合成好的外围带有大量重氮盐基团的超支化聚合物溶液中，或在将该超支化聚合物溶液用水或有机溶剂Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺稀释１００倍以下的稀释溶液中（在低于４℃，以保证酶不失活的条件下），将载体浸泡半个小时以上；２）然后将载体取出，用水清洗，再将其浸入含酶的缓冲溶液中（缓冲溶液用以保证酶不失活），在４℃以下吸附４小时以上，以达到饱和吸附，即完成固定化酶的过程。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李昕阳，范鹏伟，黄哲，林章凛，王晓工，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]