一种调控植物木质素含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种调控植物木质素含量的方法。本发明专利技术所提供的调控植物木质素含量的方法，是将含有４ＣＬ１基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物；将含有反义４ＣＬ１基因的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。本发明专利技术通过在植物细胞中用载体引入４ＣＬ１基因或反义４ＣＬ１基因，来生产木质素含量升高或降低的转基因植物特别是转基因树木，为培育木质素含量降低或升高的植物以及改良树木材性提供了一条重要的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域中。
技术介绍
木质素是由三种醇单体或单木质酚(对香豆醇、松柏醇、芥子醇)合成的一种 复杂的酚类聚合物。在细胞壁的木质化过程中，木质素渗入到细胞壁中，填充于纤 维素构架内，如导管和管胞细胞的形成。由于木质素的渗入，加大了细胞壁的硬度， 增强了细胞的机械支持力或抗压强度，促进机械组织的形成，以有利于巩固和支持 植物体及水分输道等作用，同时由于木质素的化学特性，如不可溶性和复杂的酚类 聚合物，使得木质部具有细胞壁疏水性，也增强了抗病能力。树木的次生木质部有纤维素(e-l-4-糖苷)木质素(苯基多聚物)和半纤维素 (异型多糖)，比例约为2: 1: 1。在树木生长时，纤维素微纤丝为细胞壁提供张力， 木质素增加纤维素微纤丝的硬度。木质素含量高的木材由于硬度高而广泛用于建筑 和家具领域。但在造纸过程中却需要清除木质素。目前去除木浆中的木质素一般需 借助毒性较高的化学物质，这道工序是造纸工业中最耗费能源、对环境危害最大的 一个环节。无论是提高树木的木质素含量还是降低木质素含量都将有益于生产。从策略上说，可以从多个方面进行木质素含量控制(l)控制木质素合成途径中 的各种酶系的合成是一个重要途径，如对从PAL酶到过氧化物酶/漆酶等进行反义 基因转化有可能达到目的；(2 )改变木质素的结构组成和化学性质。由于研究木质 素含量遗传变异的重要目的之一就是为工业造纸服务，在难以直接降低木质素含量 情况下，改变木质素的结构组成有可能间接地达到同样的效果；(3)必须认识到木质 素的前体是在细胞质内合成的，然后转移到细胞壁并进行脱氢聚合形成木质素，因 此木质素的合成调控也需注意涉及到一些非酶化学分子的作用，即传递运输过程的 控制，但这方面的研究至今却很少见报道研究。单个酶的作用及多个酶间的相互作 用对于探索木质素的合成机理有重要意义，因此木质素合成酶的分子生物学特性及 作用机理研究日益受重视。目前直接应用基因工程的方法来改变木质素含量的研究已有报道。Piquemal等 从冈尼桉(Eucalyptus)分离出来的CCR (羟基肉桂酰辅酶A还原酶)(EC1. 2. 1. 44) 酶的cDNA的反义构建载体，通过农杆菌(Agrobacerium)转化到烟草(^ico"a7 3 ta&c鹏L)上，结果显示出在稳态时CCRraRNA含量和CCR活性下降，且含量下降的植株木质部细胞壁呈橙棕色，紫丁香基与愈创木基的比率提高，且出现不正常细胞壁酚类物质。然而CCR活性严重下降的植物除了表现出木质素下降外，还表现出 形体小、叶形异常和绉縮导管等特征。通常认为CAD (轻基肉桂醇脱氢酶)是催化 木质素前体合成的最后一步的酶，因此降低CAD活性有可能减少木质素前体的合成。 Baucher等研究将从毛果杨X美洲黑杨(尸.z^z'c力ocarpa 7bn Groy X尸. ofe"ojVes #arW.)分离出来的CAD酶的cDNA通过农杆菌进行正义和反义转化到 欧洲山杨X银白杨(尸^reM/7a厶X尸.s7力a Z.)中，结果表明3个反义转化和2 个共抑制的品系的木质部组织CAD活性下降70%，在CAD活性少于6 0%的品系中， 可检测到红色的木质部，但木质素含量和组成与对照品系相似，并未下降。但是细 胞壁的化学特性不同，应用间苯三酚染色后，正常品系的木质部呈典型的淡红色， 而CAD活性下降的品系染色后呈棕红色。用NaOH处理后，通过将细胞壁中具有碱 溶性的部分进行酸化处理后，具有红色木质部的品系的木质素可沉淀，而白色木质 部的品系的木质素不沉淀。光谱分析显示出红色木质部的杨树香兰素和紫丁香基醛 含量提高。纸浆试验证明CAD活性下降的品系只有少量的木质素存于纸浆中。类似 的报道还有Higuchi等，CAD反义转化的植株木质素含量并不下降，但木质素的组 成和化学性质发生了改变。CAD反义转化后木质素含量不下降，这与自然界中火炬松 CAD突变体的结果不一致。OMT是重要的控制木质素合成酶，Dwivedi等将美洲山杨 中编码0MT(EC2. 1. 1.6)酶的反义序列与CaMV35S基因的增强子、启动子和终止子组 装后转化到烟草基因组内后，转基因植株表现出正常的表现型。在4个转基因植株 的茎部中，0MT (咖啡酸0-甲基转移酶)酶的活性平均下降29%。茎部木材化学分析 结果显示出紫丁香基单位含量下降，木质素含量下降水平与0MT酶活性程度相关。 Doorsselaere等应用反义COMT(咖啡酸甲基转移酶)转化欧洲山杨X银白杨后，COMT 活性下降为正常的5%，但木质素含量并不下降。根据应用转化单酶基因方法改造烟 草木质素含量的研究报道，降低单个酶0MT、 CAD、 P0D(过氧化物酶)、C0MT和F5H (阿魏酸5-羟基化酶)等酶活性，并不影响木质素含量变化，而降低酶系PAL (苯 丙氨酸解氨酶)、C4H (肉桂酸4-羟基化酶)、和CCR (羟基肉桂酰辅酶A还原酶) 等酶活性，则可以降低木质素含量。通过鉴定树木与草本植物中木质素合成途径的酶和基因，以往努力减少树木中木质素的含量，通过下调编码咖啡酸o-甲基转移酶或肉桂醇脱氢酶含量没有获得成功，只是修饰了木质素的结构。在转基因烟草中降低这些酶的含量显示没有减少木 质素的含量。然而通过在转基因烟草中降低苯丙氨酸脱氨酶含量，显著减少了木质 素的含量，该酶催化木质素合成途径中进入苯丙基衍生物的途径导致了一系列表型 不正常。同样在转基因拟南芥和烟草中通过降低肉桂酸辅酶A还原酶的含量也降低 了 (25%-40%)木质素的含量，但导致了细胞壁的委縮和矮化。这些草木系统清晰地 表明了修饰次生代谢和木质素质量的可能性。因此，树木生物技术的问题是能否降低木质素含量而不影响结构的硬度和树木的生长。杨树的4CL (4-香豆酸辅酶A连接酶)蛋白Pt4CLl、 Pt4CL2催化羟基肉桂酸与 CoA的连接反应，为木质素和类黄酮的生物合成提供酚类前体。Pt4CL2在茎和叶的 表皮细胞中表达，与类黄酮合成相关。Pt4CLl是在发育的木质部维管组织中表达， 和木质素的合成相关。 专利技术创造内容本专利技术的目的是提供。本专利技术所提供的调控植物木质素含量的方法，是将含有4CL1基因的表达载体转 化植物，得到木质素含量升高的植物；将含有反义4CL1基因的表达载体转化植物， 得到木质素含量降低的植物。所述4CL1基因是具有序列表中序列1的多核苷酸序列，所述反义4CL1基因是 具有序列表中序列2的多核苷酸序列。序列表中的序列1由1741个碱基组成，序列2由1637个碱基组成。用于构建所述含有4CL1基因的表达载体或含有反义4CL1基因的表达载体的出 发载体可为Ti类质粒载体和病毒载体，优选为Ti类质粒载体。所述Ti类质粒载体优选为双元载体，如pBI121。所述含有4CL1基因的表达载 体优选为pB4CL;所述含有反义4CL1基因的表达载体优选为pBan4CL。所述转化方法可为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法，优 选为农杆菌介导转化法。本专利技术方法中，所述植物可为草本植物或木本植物，其中，所述草本植物优选 为烟草，所述木本植物优选为杨树。本专利技术通过在植物细胞中用载体引入4CL1基因或反义4CL1基因，来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控植物木质素含量的方法，是将含有反义４ＣＬ１基因的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋湘宁，陆海，赵艳玲，陈雪梅，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]