总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是：ａ）其氨基酸序列是序列表中序列２所示的蛋白质；ｂ）在序列表中序列２所示的氨基酸序列中经过取代和／或缺失和／或添加一个或几个氨基酸且与总黄酮合成相关的由ａ）衍生的蛋白质。该蛋白的编码基因是：１）其核苷酸序列是序列表中序列１的ＤＮＡ分子；２）其编码序列是序列表中序列１自５′末端第３９－７３８位的ＤＮＡ分子；３）在严格条件下可与序列表中序列１限定的ＤＮＡ序列杂交且编码上述总黄酮合成相关蛋白的ＤＮＡ分子。本发明专利技术的总黄酮合成相关蛋白及其编码基因对解决雪莲野生资源短缺的问题有重要价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
雪莲花又名雪莲，菊科风毛菊属。是民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。一般分布于海拔2400米至4000米以下的高山流石滩上。早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪莲(雪荷花)(S.involucrata Kar.et Kir.)和水母雪莲(S.medusa Maxim)。新疆天山雪莲主要分布在新疆天山、昆仑山、阿尔泰山和帕米尔高原，属国家渐危三级植物。而水母雪莲(Saussurea medusa Maxim.)是藏药“雪莲”药材的原植物，分布在我国青海、甘肃、西藏等地，是藏药中的名贵药材。雪莲中含黄酮、生物碱、内酯、甾醇、挥发油、多糖等多种成分，其有效成分主要为黄酮类化合物。黄酮类化合物的药理作用包括抗癌、抗肿瘤，抗心脑血管疾病，镇咳祛痰，抗炎、镇痛作用，免疫调节作用，雌性激素样作用，抗菌及抗病毒作用，抗氧化、抗衰老作用，抗辐射。如用来治疗偏瘫的雪莲通脉丸、雪莲注射液和治疗脑动脉硬化与缺血性中风的雪莲通脉口服液，都是以黄酮类化合物含量为质量标准的。雪莲黄酮药理作用显著，如水母雪莲黄酮成分对中枢神经系统有抑制作用；以黄酮类化合物为有效成分的雪莲注射液治疗偏头痛效果显著。 黄酮类化合物的生物合成是通过苯丙烷类生物合成途径实现的。是由1分子4-香豆酰-CoA和3分子丙二酰-CoA在查耳酮合酶(CHS)催化下产生查耳酮(苯基苯乙烯酮)开始的，查耳酮合酶是将苯丙烷类代谢途径引向黄酮类合成的第一个最关键酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供总黄酮合成相关蛋白及其编码基因与应用。 本专利技术提供的总黄酮合成相关蛋白，是一种查耳酮异构酶，命名为chi，该酶是如下a)或b)的蛋白 a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与总黄酮合成相关的由a)衍生的蛋白质。 其中，序列表中序列2由232个氨基酸残基组成。 为了使a)中的chi便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。 表1.标签的序列 上述b)中的chi可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的chi的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第39-738所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。 chi蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。 所述的基因具体可是如下1)或2)或3)或4)的基因 1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子； 2)其编码序列是序列表中序列1自5′末端第39-738位的DNA分子 3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述总黄酮合成相关蛋白的DNA分子； 4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述总黄酮合成相关蛋白的DNA分子。 所述步骤4)中的基因，与1)或2的基因最好有95％以上的同源性。 序列表中的序列1由831个碱基组成，自5′末端第39-738位为编码区，编码序列表中序列2的蛋白质。 上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。 扩增上述chi基因全长或任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。 含有上述chi基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本专利技术的保护范围。 可用现有的植物表达载体构建含有chi基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本专利技术的chi基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。 使用chi基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本专利技术的chi基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。 本专利技术的另一个目的是提供一种培育总黄酮含量提高的雪莲的方法。 本专利技术所提供的培育总黄酮含量提高的雪莲的方法，是将所述chi基因导入新疆天山雪莲中，获得总黄酮含量提高的雪莲。 本专利技术还提供了一种生产总黄酮的方法。 本专利技术所提供的生产总黄酮的方法，是通过对上述方法获得的总黄酮含量提高的雪莲的毛状根根系进行诱导产生不定芽，得到新疆天山雪莲再生苗，培养所述雪莲再生苗生产总黄酮。 本专利技术构建了水母雪莲cDNA文库，并利用此文库通过简并引物筛选到水母雪莲chi基因，利用特异引物通过PCR克隆了chi基因，并构建了含有chi基因的重组表达载体，获得了转chi基因的新疆雪莲。转chi基因的新疆雪莲的总黄酮和芹菜素含量的测定结果表明，转chi基因的新疆雪莲与转空载体的新疆雪莲相比，总黄酮和芹菜素含量有明显的提高，说明chi蛋白是一种黄酮类物质合成相关蛋白。将所述chi基因导入雪莲中，可以获得总黄酮含量升高的雪莲；可以利用总黄酮含量升高的雪莲的毛状根根系进行诱导，产生不定芽，获得再生苗，培养再生苗生产总黄酮。本专利技术的总黄酮合成相关蛋白及其编码基因对解决雪莲野生资源短缺的问题有重要价值。 附图说明 图1为转基因新疆雪莲再生苗的PCR检测 图2为不同类型新疆雪莲再生苗的芹菜素和总黄酮含量 图3为新疆雪莲再生苗的HPLC图谱 (a)在紫外337nm处芹菜素标准品谱图；(b)转chi基因毛状根再生苗图谱。 具体实施例方式 实施例1、雪莲查耳酮异构酶基因(chi)的克隆 1.雪莲cDNA文库的构建 建库所用水母雪莲1-15天愈伤组织红色系，通过如下方法诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，是如下ａ）或ｂ）的蛋白：ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；ｂ）在序列表中序列２所示的氨基酸序列中经过取代和／或缺失和／或添加一个或几个氨基酸且与总黄酮合成相关的由ａ）衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵德修，李风霞，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]