调控植物木质素含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种调控植物木质素含量的方法。本发明专利技术所提供的调控植物木质素含量的方法，是将含有ＧＲＰ１．８启动子－４ＣＬ１融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物；将含有反义４ＣＬ１基因和富甘氨酸蛋白ｇｒｐ１．８基因启动子的融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。本发明专利技术通过在植物细胞中引入４ＣＬ１基因和富甘氨酸蛋白ｇｒｐ１．８基因启动子的融合基因或反义４ＣＬ１基因和富甘氨酸蛋白ｇｒｐ１．８基因启动子的融合基因，来生产木质素含量升高或降低的转基因植物特别是转基因树木，为培育木质素含量降低或升高的植物以及改良树木材性提供了一条重要的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域中一种。
技术介绍
植物进化形成一个有效的维管组织对于陆生植物的出现是至关重要的。特别对于多年生木本植物，由于它的多年生和特异性形成木材的特点，维管组织显得更为重要。植物维管组织包括韧皮部与木质部。木质部和韧皮部都是在植物发育过程中由形成层细胞分化和薄璧细胞的再分化而形成的。细胞分化的关键是细胞按照一定程序发生差别基因表达。差别基因表达的关键环节是合成专一性的mRNA。现在通常认为基因的差别表达是该基因的特异调节元件如启动子等来调控的。最新研究认为组织特异性基因的启动子对该基因的组织特异性表达起重要作用。为了研究植物维管组织发育和分化过程中的分子机理，近年来对维管组织特异性启动子的研究成为热点。Keller等在富甘氨酸蛋白grp1.8基因启动子的研究中发现菜豆富甘氨酸蛋白grp1.8基因启动子存在顺式元件的正调节与负调节之间的相互协调。在全长496bp的启动子中包括四个组织特异调控元件NRE负调控元件，RSE调控元件(26bp，-98到-73)，VSE调控元件，SE1(24bp，-119到-96)，SE2。将花椰菜病毒35S启动子最小片段(在转基因烟草中不表达GUS基因活性)与grp1.8启动子的一个169bp(-205到-35)与141bp(-205到-64)的片段(包括NRE，SE1，RSE)相连接，并转化烟草，发现在维管组织中能特异性的检测到GUS活性。研究发现RSE能特异性激活基因在维管组织特异性表达。同时发现VSE调控元件不仅对基因的特异性表达起作用，还能促进基因表达的数量。反义技术是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成地特定互补的DNA或RNA片断(或化学修饰产物)抑制或封闭基因表达的技术。主要包括反义寡聚核苷酸技术、反义RNA技术和核酶(Ribozyme)技术等。由于植物体细胞全能性和组培体系的建立，外源反义RNA在真核细胞中的生物学意义的研究进展较快。第一个应用于植物的反义RNA系统是将细菌的CAT基因接上农杆菌的Nos启动子和3’末端之后连在pUC18载体上，转化胡萝卜的原生质体，发现CAT基因的表达受到了抑制。荷兰学者将查尔酮(CHS)的cDNA与CaMV的35S启动子反向连接，转化矮牵牛后再生的转基因植株，其花色从原来的紫红色变为粉红色并夹杂有白色，有些植株花朵完全成白色。一系列检测表明，转基因矮牵牛内源CHS mRNA以及酶蛋白含量降低，从而减少了类黄酮的生物合成。回交试验还表明这一性状是由染色体稳定遗传给后代的。这是首次利用人工反义RNA系统调节植物基因组的活动取得了成功，为园艺学育种开辟了一个新的领域。木质素是由三种醇单体或单木质酚(对香豆醇、松柏醇、芥子醇)合成的一种复杂的酚类聚合物。在细胞壁的木质化过程中，木质素渗入到细胞壁中，填充于纤维素构架内，如导管和管胞细胞的形成。由于木质素的渗入，加大了细胞壁的硬度，增强了细胞的机械支持力或抗压强度，促进机械组织的形成，以有利于巩固和支持植物体及水分输道等作用，同时由于木质素的化学特性，如不可溶性和复杂的酚类聚合物，使得木质部具有细胞壁疏水性，也增强了抗病能力。树木的次生木质部有纤维素(β-1-4-糖苷)木质素(苯基多聚物)和半纤维素(异型多糖)，比例约为2∶1∶1。在树木生长时，纤维素微纤丝为细胞壁提供张力，木质素增加纤维素微纤丝的硬度。木质素含量高的木材由于硬度高而广泛用于建筑和家具领域。但在造纸过程中却需要清除木质素。目前去除木浆中的木质素一般需借助毒性较高的化学物质，这道工序是造纸工业中最耗费能源、对环境危害最大的一个环节。无论是提高树木的木质素含量还是降低木质素含量都将有益于生产。从策略上说，可以从多个方面进行木质素含量控制(1)控制木质素合成途径中的各种酶系的合成是一个重要途径，如对从PAL酶到过氧化物酶/漆酶等进行反义基因转化有可能达到目的；(2)改变木质素的结构组成和化学性质。由于研究木质素含量遗传变异的重要目的之一就是为工业造纸服务，在难以直接降低木质素含量情况下，改变木质素的结构组成有可能间接地达到同样的效果；(3)必须认识到木质素的前体是在细胞质内合成的，然后转移到细胞壁并进行脱氢聚合形成木质素，因此木质素的合成调控也需注意涉及到一些非酶化学分子的作用，即传递运输过程的控制，但这方面的研究至今却很少见报道研究。单个酶的作用及多个酶间的相互作用对于探索木质素的合成机理有重要意义，因此木质素合成酶的分子生物学特性及作用机理研究日益受重视。目前直接应用基因工程的方法来改变木质素含量的研究已有报道。Piquemal等从冈尼桉(Eucalyptus)分离出来的CCR(羟基肉桂酰辅酶A还原酶)(EC1.2.1.44)酶的cDNA的反义构建载体，通过农杆菌(Agrobacerium)转化到烟草(Nicotianatabacum L.)上，结果显示出在稳态时CCR mRNA含量和CCR活性下降，且含量下降的植株木质部细胞壁呈橙棕色，紫丁香基与愈创木基的比率提高，且出现不正常细胞壁酚类物质。然而CCR活性严重下降的植物除了表现出木质素下降外，还表现出形体小、叶形异常和绉缩导管等特征。通常认为CAD(羟基肉桂醇脱氢酶)是催化木质素前体合成的最后一步的酶，因此降低CAD活性有可能减少木质素前体的合成。Baucher等研究将从毛果杨×美洲黑杨(P.trichocarpa Torr.Et Groy×P.deltoides Marsh.)分离出来的CAD酶的cDNA通过农杆菌进行正义和反义转化到欧洲山杨×银白杨(P.tremula L.×P.alba L.)中，结果表明3个反义转化和2个共抑制的品系的木质部组织CAD活性下降70％，在CAD活性少于60％的品系中，可检测到红色的木质部，但木质素含量和组成与对照品系相似，并未下降。但是细胞壁的化学特性不同，应用间苯三酚染色后，正常品系的木质部呈典型的淡红色，而CAD活性下降的品系染色后呈棕红色。用NaOH处理后，通过将细胞壁中具有碱溶性的部分进行酸化处理后，具有红色木质部的品系的木质素可沉淀，而白色木质部的品系的木质素不沉淀。光谱分析显示出红色木质部的杨树香兰素和紫丁香基醛含量提高。纸浆试验证明CAD活性下降的品系只有少量的木质素存于纸浆中。类似的报道还有Higuchi等，CAD反义转化的植株木质素含量并不下降，但木质素的组成和化学性质发生了改变。CAD反义转化后木质素含量不下降，这与自然界中火炬松CAD突变体的结果不一致。OMT是重要的控制木质素合成酶，Dwivedi等将美洲山杨中编码bi-OMT(EC2.1.1.68)酶的反义序列与Ca MV3 5S基因的增强子、启动子和终止子组装后转化到烟草基因组内后，转基因植株表现出正常的表现型。在4个转基因植株的茎部中，OMT(咖啡酸O-甲基转移酶)酶的活性平均下降29％。茎部木材化学分析结果显示出紫丁香基单位含量下降，木质素含量下降水平与bi-OMT酶活性程度相关。Doorsselaere等应用反义COMT(咖啡酸甲基转移酶)转化欧洲山杨×银白杨后，COMT活性下降为正常的5％，但木质素含量并不下降。根据应用转化单酶基因方法改造烟草木质素含量的研究报道，降低单个酶OMT、CAD、POD(过氧化物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控植物木质素含量的方法，是将含有ＧＲＰ１．８启动子－４ＣＬ１融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物；将含有ＧＲＰ１．８启动子－反义４ＣＬ１融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋湘宁，陆海，赵艳玲，陈雪梅，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]