【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种用于检测人nt5dc3蛋白的试剂盒。
技术介绍
1、流行病学和临床证据表明，2型糖尿病(t2d)与罹患癌症(尤其是结肠癌)的风险增加相关。对65,470例临床病例的统计分析结果表明，患有t2d的人后期患膀胱癌，乳腺癌，结肠直肠癌和肾癌的风险比正常人群要高20％至40％(shi等,the lancet,2014；hua等,cancer letter,2016；johnson等,diabetologia,2012)。越来越多的研究揭示了这两种疾病之间潜在的生物学联系，一些研究表明，高血糖症可能是直接将糖尿病和癌症联系起来的机制之一(giovannucci等,diabetes care,2010)。血糖过高的情况直接重编程表观基因组，其中dna羟甲基化和蛋白质磷酸化被认为是两种疾病发展的关键开关和调控途径(wu等,nature,2018)。但是具体关键调控基因及其信号通路，研究尚不清晰。nt5dc3是一个含有5'核苷酸酶结构域的家族成员，编码一个很大程度上未表征的跨膜蛋白。对葡萄膜黑色素瘤中circrna异常表达的研究表明，前10个上调的circrna中包括nt5dc3这个因子(chen等,oncotarget,2017)，但是其具体功能报道极少，其在二型糖尿病、肠癌及t2d诱发的肠癌等疾病中的作用暂无报道。在糖尿病和结肠癌领域，nt5dc3作为一种可能的疾病相关的基因，其具体功能及其相关信号途径，报道很少，需要进一步研究确定。
2、在我们前期研究中发现，nt5dc3参与糖尿病和恶性肿瘤的转
3、另一方面，wb的最低检测限度只能达到48μg/ml的水平，检测灵敏度不够，达不到纯度检测和微量检测的要求，且无法准确检测细胞中微量的nt5dc3蛋白的含量。因此，我们开发一种可以更加灵敏的检测方法非常必要。
4、综上所述，本专利技术涉及一种人nt5dc3蛋白高灵敏elisa检测试剂盒具有很好的实用价值。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于：提供一种高通量的人nt5dc3蛋白超级灵敏的elisa检测试剂盒。
2、本专利技术的目的是这样实现的：涉及到一种nt5ddc3的单克隆抗体。
3、本专利技术中的研究对象nt5dc3蛋白，是一个具有去磷酸化和水解能力的蛋白，含有548个氨基酸(https：//www.uniprot.org/uniprot/q86uy8)。
4、目前尚无文献报道在人血清样品和细胞样品中准确检测到nt5dc3蛋白；也尚无针对人血清样品和细胞样品中的nt5dc3蛋白含量提供一种准确、简便、灵敏度高的检测手段；也尚无文献报道nt5dc3蛋白的elisa检测试剂盒以及该类试剂盒在人血清样品和细胞样品检测中的应用。
5、本专利技术旨在为临床和实验室人血清样品和细胞样品中nt5dc3蛋白含量提供准确、简便、灵敏度高、并可被广泛使用的检测手段。
6、本专利技术人经过广泛而深入的研究，采用酶联免疫吸附法(elisa)检测nt5dc3蛋白在人血清和细胞中的表达水平，并首次证实在人的血清中存在nt5dc3蛋白。
7、本专利技术第一方面，提供了一种nt5dc3蛋白的elisa检测试剂盒，所述的elisa检测试剂盒包括：
8、(1)包被有nt5dc3抗体的elisa酶标板，所述的包被抗体为兔源(可测人源样本)nt5dc3的多克隆抗体；较优的，检测nt5dc3的多克隆抗体购自invitrogen公司；最优的，抗体工作浓度为2μg/ml。
9、(2)检测nt5dc3抗原的抗体，为兔抗人nt5dc3的多克隆抗体；较优的，小鼠抗人nt5dc3的单克隆抗体购自invitrogen公司；最优的，检测抗体的工作浓度为0.5μg/ml。
10、(3)酶标二抗，hrp(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗兔igg；较优的，hrp标记的山羊抗兔igg购自invitrogen公司；最佳的，稀释浓度为1：10000。
11、⑷标准蛋白，为重组人nt5dc3融合蛋白；较优的，重组人nt5dc3融合蛋白购自novus biologicals公司。
12、(5)所述的试剂盒，还包括有：常规的样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、elisa酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液；
13、所述的试剂盒，eli sa酶标板为市售的elisa酶标板，优选thermofisher公司的elisa酶标板(06孔单条可拆酶标板)；
14、包被缓冲液，选用1x pbs，ph：7.4；
15、封闭液，选用含3％牛血清白蛋白+pbs溶液的封闭液；
16、elisa酶标板洗涤液，较优的为含0.05％tween-20的1xpbs溶液；
17、样品稀释液：样品为血清时，较优的为1x pbs，ph：7.4；
18、抗体稀释液，选用1x pbs；
19、显色液，选用solarbio公司的3,3-5,5-四甲基联苯胺(tmb)；
20、终止液，较优的为2mo1/l的硫酸溶液。
21、本专利技术所述的一种nt5dc3蛋白的elisa检测试剂盒，所用的试剂、条件进一步优化：
22、(1)包被抗体的优化：本专利技术的试剂盒，分别选用不同的抗体包被：兔抗人nt5dc3的多克隆抗体(invitrogen公司)、兔抗人nt5dc3的多克隆抗体(abnova公司)、兔抗人nt5dc3的多克隆抗体(博奥森公司)，检测浓度选用7.5μg/ml，5μg/ml，2μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml。结果发现选用兔抗人nt5dc3的多克隆抗体(abnova公司)、兔抗人nt5dc3的单克隆抗体(博奥森公司)作为包被抗体均存在明显的非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性；但是使用兔抗人nt5dc3的多克隆抗体(invitrogen公司)则没有明显的非特异性反应，标准品的浓度和吸光度具有较好的相关性。经过反复优化，抗体工作浓度2μg/ml为最佳，标准品的浓度和吸光度数值的相关性最好。
23、(2)检测抗体的优化：本专利技术的试剂盒，分别选用不同的抗体作为检测抗体：当包被抗体为兔抗人nt5dc3的三种多克隆抗体(invitrogen公司、abnova公司、博奥森公司)时，选用兔抗人nt5dc3的两种多克隆抗体(invitrogen公司、abnova公司)分别作为检测抗体。检测浓度选用2μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测人NT5DC3蛋白含量的试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述的检测试剂为检测血清中人NT5DC3蛋白含量的试剂。
3.如权利要求1-2任一所述的用途，其中所述的检测试剂为ELISA检测试剂。
4.如权利要求1-3任一所述的用途，其中所述的肿瘤为结肠癌。
5.如权利要求2-4任一所述的用途，其中所述试剂盒含有PBS作为血清样本稀释剂。
6.一种人NT5DC3蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒包括：
7.如权利要求6所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒中，包被缓冲液，为1X PBS，pH：7.4；封闭液，为含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液；ELISA酶标板洗涤液，为含0.05％Tween-20的1X PBS溶液；抗体稀释液，为1X PBS；显色液，为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；终止液，为2mol/L的硫酸溶液。
8.如权利要求6所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检
9.根据权利要求6-8所述的ELISA试剂盒在检测人血清和细胞中NT5DC3蛋白含量中的应用，其特征在于，所述的应用的具体检测方法包括以下步骤：制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将人NT5DC3的单克隆抗体稀释成2μg/mL；样本用样品稀释液以1：1稀释，加样至ELISA酶标板孔中，室温孵育1-2小时；重组人NT5DC3融合蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，加样至ELISA酶标板孔中，室温孵育1-2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次，甩干；将检测NT5DC3抗原的抗体稀释成0.5μg/mL，加至ELISA酶标板孔中，室温孵育1-2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次，甩干；加入HRP标记的检测抗体，室温孵育1-2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤6-8次，甩干；加入显色液，室温避光孵育10-20分钟，加入终止液终止反应，在酶标仪上读数。
10.根据权利要求6-8所述的ELISA试剂盒在检测人血清中NT5DC3蛋白含量中的应用，其特征在于，所述的应用的具体检测方法如下：检测前，首先制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将人NT5DC3的多克隆抗体稀释成2μg/mL，在ELISA酶标板的每孔中加入100μL，封板后置于4℃孵育过夜，备用；血清样本用样品稀释液1XPBS，pH：7.4以1：1稀释，以100μL/孔的体积加样，室温孵育2小时；NT5DC3重组蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，以100μL/孔的体积加样，室温孵育2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μL，洗涤3-5次，甩干，将NT5DC3检测抗体稀释成0.5μg/mL，每孔100μL，室温孵育1小时30分钟；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μL，洗涤3-5次，甩干；加入HRP标记的检测抗体，每孔100μL，室温孵育1小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μL，洗涤6-8次，甩干；加入TMB，每孔100μL，室温避光孵育10-20分钟，加入2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL；在酶标仪上450nm测定吸光值。
...【技术特征摘要】
1.检测人nt5dc3蛋白含量的试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述的检测试剂为检测血清中人nt5dc3蛋白含量的试剂。
3.如权利要求1-2任一所述的用途，其中所述的检测试剂为elisa检测试剂。
4.如权利要求1-3任一所述的用途，其中所述的肿瘤为结肠癌。
5.如权利要求2-4任一所述的用途，其中所述试剂盒含有pbs作为血清样本稀释剂。
6.一种人nt5dc3蛋白的elisa检测试剂盒，其特征在于，所述的elisa检测试剂盒包括：
7.如权利要求6所述的elisa检测试剂盒，其特征在于，所述的elisa检测试剂盒中，包被缓冲液，为1x pbs，ph：7.4；封闭液，为含3％牛血清白蛋白+pbs溶液的封闭液；elisa酶标板洗涤液，为含0.05％tween-20的1x pbs溶液；抗体稀释液，为1x pbs；显色液，为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；终止液，为2mol/l的硫酸溶液。
8.如权利要求6所述的elisa检测试剂盒，其特征在于，所述的elisa检测试剂盒中用于血清检测，样品稀释液为1xpbs，ph：7.4。
9.根据权利要求6-8所述的elisa试剂盒在检测人血清和细胞中nt5dc3蛋白含量中的应用，其特征在于，所述的应用的具体检测方法包括以下步骤：制备检测elisa酶标板：包被缓冲液将人nt5dc3的单克隆抗体稀释成2μg/ml；样本用样品稀释液以1：1稀释，加样至elisa酶标板孔中，室温孵育1-2小时；重组人nt5dc3融合蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，加样至elisa酶标板孔中，室温孵育...
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