一种生物活性纳米医用胶原的制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种生物活性纳米医用胶原的制备方法和用途：取富含胶原的动物组织，经脱脂以及洗涤后，得到胶原提取的原料；将胶原提取的原料依次经过浸泡、酶解、离心、盐析、复溶、透析、冻干，低温球磨≥24h，得到纳米胶原。本发明专利技术制备的胶原纯度高、活性得到有效保留，且杂质少。本发明专利技术制备的纳米胶原在医药等领域具有广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种生物活性纳米医用胶原的制备方法和用途
本专利技术属于医学生物材料领域，具体涉及一种纳米尺度胶原的制备。
技术介绍
目前具有医用生物活性的纳米级胶原的产品很少见到报道，且目前采用酶解加超滤的方法获得纳米级胶原蛋白，不仅工艺复杂，而且通常采用的酶解温度较高，造成胶原医用生物活性大大降低，超滤法的使用导致其纳米胶原产率较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生物活性纳米医用胶原的制备方法和用途。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种生物活性纳米医用胶原的制备方法，该纳米医用胶原由提取的天然胶原经球磨而制成，包括以下步骤：1)取富含胶原的动物组织，经脱脂以及洗涤后，得到胶原提取的原料；2)将胶原提取的原料依次经过浸泡、酶解、离心、盐析、复溶、透析、冻干，得到(海绵状)胶原；3)将步骤2)得到的(海绵状)胶原低温球磨≥24h，得到纳米胶原。所述步骤1)具体包括以下步骤：1.1)预处理：取新鲜的动物跟腱、动物皮或动物关节软骨，洗净后去除脂肪、真皮层、筋膜、皮毛，得到富含胶原的动物组织；1.2)脱脂：将富含胶原的动物组织依次经切细、双蒸水洗涤、绞碎后置于氯仿-甲醇混合溶剂中浸泡脱脂，浸泡时间为3～6h；1.3)洗涤：将脱脂的富含胶原的动物组织于NaCl和NaHCO3混合水溶液中浸泡，NaCl质量分数为2％～30％，NaHCO3质量分数为1％～10％，浸泡时间为3～8h；然后依次经双蒸水洗涤、离心后过300～800目筛，筛余物即为胶原提取的原料。所述酶解的条件为：胃蛋白酶:胶原提取的原料的质量比为0.1～5:10～80，酶解消化温度为2～4℃，酶解消化时间为1～7天。所述酶解前将胶原提取的原料浸没于0.5～1M醋酸中浸泡10～72h。所述盐析采用质量分数2％～30％的NaCl水溶液。所述复溶采用0.5～10M醋酸为溶剂。所述透析的截留分子量为8000～20000Da。所述球磨温度为-70℃～-20℃，时间为24～72h。上述制备方法制备的生物活性纳米医用胶原在制备用于抑制神经胶质细胞活化的药物中的应用。上述制备方法制备的生物活性纳米医用胶原在制备用于海马神经元缺失性疾病治疗的药物以及增强皮肤细胞、受损组织细胞、神经细胞代谢的药物中的应用。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术中的制备方法简单易行，成本低，工艺流程可控性强。本专利技术制备的纳米胶原纯度高、活性得到有效保留，且杂质少、生产效率高。本专利技术制备的纳米胶原在医药等领域具有广泛的应用价值。附图说明图1为纳米胶原制备流程图。图2为胶原显微视图。图3为MTT法检测细胞生物活性的结果。图4为外泌体复合胶原生物支架作用结果之一。图5为外泌体复合胶原生物支架作用结果之二。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。1.主要试剂和仪器胃蛋白酶、氯仿、冰醋酸、NaHCO3、NaCl、高速离心机、冷冻干燥机、深低温冰箱、绞肉机、透析膜、液氮行星球磨机。2.方法(1)生物材料预处理：取新鲜的牛(猪、羊或其他动物)皮，洗净切除皮下脂肪及真皮层，剔除筋膜，去毛，切细。(2)脱脂：经过切细的生物材料用双蒸水洗涤，绞肉机内绞碎，氯仿-甲醇混合溶剂(体积比1:1)中2～6℃(例如4℃)浸泡脱脂，浸泡时间为3～6h(例如4h)，期间间断搅拌。(3)洗涤：将上述脱脂的生物材料于NaCl和NaHCO3混合水溶液(NaCl质量分数为10％，NaHCO3质量分数为10％)中2～6℃(例如4℃)浸泡，浸泡时间为3～8h(例如4h)，期间不断搅拌；然后双蒸水洗涤3～5次(例如，3次)，再以1000～20000r/min(例如20000r/min)离心5～60min(例如，15min)，倒掉液体，固体使用300～800目(例如，800目)筛子去除杂质、血清等成分，所得沉淀(筛余物)即为胶原提取的原料。(4)提取胶原(图1)：抽提：将原料浸没于0.5～1M醋酸(例如，1M)中2～6℃(例如4℃)浸泡10～72h(例如，48h)后，加入胃蛋白酶进行抽提(消化)，于2～4℃(例如置于4℃冰箱内)共抽提1～7天(例如，2～3天)，期间磁力搅拌器连续搅拌，得到抽提液；胃蛋白酶:原料的质量比为0.1～5:10～80(例如，1:10)。离心：将上述抽提液于1000～20000r/min(例如20000r/min)离心5～60min(例如，15min)，去除沉淀，所得上清液为胶原粗提液。盐析：胶原粗提液加入质量分数2％～30％NaCl水溶液(例如，10％)中至有大量白色沉淀析出，2～6℃(例如4℃)静置5～60min(例如，60min)，于1000～20000r/min(例如20000r/min)离心3～60min(例如，15min)，弃掉上清液，沉淀为粗提胶原物。复溶：粗提胶原物复溶到0.5～10M醋酸(例如，1M)中，于1000～20000r/min(例如20000r/min)离心3～60min(例如，15min)，除去不溶杂质，保留上清液。透析：将复溶步骤所得上清液放入截留分子量为8000～20000Da透析膜(例如，14000Da)中，浸入双蒸水中2～6℃(例如4℃)透析24～72h(例如，48h)，每隔1～2h换液(双蒸水)一次，透析后获得精制胶原液(透析膜包裹的液体为精致胶原液)，即生物胶原溶液。冻干：将精致胶原液放入大培养皿中，冷冻干燥机中进行冻干(-70℃缓慢升至-20℃，每2～4小时升温1～2℃)后，即可得到海绵状胶原(图2)。球磨：将海绵状胶原于液氮行星球磨机中球磨24h～72h(例如，48h)，得到纳米胶原。3.鉴定和活性分析对胶原用Co60或环氧乙烷等方法进行消毒，之后再对其成分、纯度、生物相容性进行精确鉴定。表1.胶原成分对照表将制备的海绵状胶原与I型胶原标准品的氨基酸组成对照，可以看出，二者氨基酸构成基本一致(表1)，将制备的海绵状胶原与I型胶原标准品的SDS-PAGE凝胶电泳图谱相对照，结果谱型一致，从上至下依次是γ链(分子量为130,000)、β链(分子量为98,000)、α链(分子量为97,200)，证明本实施例所制备的为纯度较高的I型胶原。经鉴定为I型胶原(或其他类型胶原)后进行球磨，将球磨后的纳米胶原通过重溶(例如水、醋酸)和冻干制成固相纳米胶原支架，与胶标准品(非纳米)制成的固相标准胶原支架一并接种骨髓间充质干细胞，进行生物活性(毒性)检测。使用MTT法对接种于两种不同支架上的骨髓间充质干细胞进行检测。随着接种时间的增长，接种于两种支架上的细胞数目不断增多，且发现纳米胶原支架具有更高的组织相容性，细胞生长更快(图3中，黑色实心为固相纳米胶原支架结果，圆形空心为固相标准胶原支架，*表示差异显著)。4.应用实例分离骨髓或脐带间充质干细胞外泌体(MSC-derivedexosomes,MSC-Exo)，外泌体数量≥10×1011/mL(10～15×1011/mL)，将纳米胶原溶解于双蒸水中，加入外泌体，磁力搅拌器搅拌均匀，配制成胶原质量分数为0.1％～10％的混合液，静置后无明显沉淀，获得混合液后，放入大培养皿中，冷冻干燥机中进行冻干后，即可得到获得复合外泌体的新型医用胶原海绵(即海绵状固体形态的MSC-Exo复合纳米胶原生物支架)，经检测外泌体在胶原中的分散浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物活性纳米医用胶原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)取富含胶原的动物组织，经脱脂以及洗涤后，得到胶原提取的原料；2)将胶原提取的原料依次经过浸泡、酶解、离心、盐析、复溶、透析、冻干，得到胶原；3)将步骤2)得到的胶原球磨≥24h，得到纳米胶原。

【技术特征摘要】
1.一种生物活性纳米医用胶原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)取富含胶原的动物组织，经脱脂以及洗涤后，得到胶原提取的原料；2)将胶原提取的原料依次经过浸泡、酶解、离心、盐析、复溶、透析、冻干，得到胶原；3)将步骤2)得到的胶原球磨≥24h，得到纳米胶原。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括以下步骤：1.1)预处理：取新鲜的动物跟腱、动物皮或动物关节软骨，洗净后去除脂肪、真皮层、筋膜、皮毛，得到富含胶原的动物组织；1.2)脱脂：将富含胶原的动物组织依次经切细、双蒸水洗涤、绞碎后置于氯仿-甲醇混合溶剂中浸泡脱脂，浸泡时间为3～6h；1.3)洗涤：将脱脂的富含胶原的动物组织于NaCl和NaHCO3混合水溶液中浸泡，NaCl质量分数为2％～30％，NaHCO3质量分数为1％～10％，浸泡时间为3～8h；然后依次经双蒸水洗涤、离心后过300～800目筛，筛余物即为胶原提取的原料。3.根据权利要求1所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李征宇，
申请(专利权)人：李征宇，
类型：发明
国别省市：陕西,61