重组胶原蛋白及其温敏水凝胶制造技术

本发明专利技术提供了胶原蛋白及其温敏水凝胶。本发明专利技术还提供了该温敏水凝胶的制备方法，包括将壳聚糖、胶原蛋白、碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺、β‑甘油磷酸钠和碳酸氢钠溶液，37℃下静置。

Recombinant collagen and its thermosensitive hydrogel

The present invention provides collagen and its thermosensitive hydrogels. The invention also provides a preparation method of the temperature sensitive hydrogel, including chitosan, collagen, carbon, N two imine hydroxysuccinimide, beta glycerophosphate and sodium bicarbonate solution, 37 DEG C under static.

【技术实现步骤摘要】
重组胶原蛋白及其温敏水凝胶
本专利技术属于多肽技术和生物医学材料领域，具体而言，本专利技术涉及重组胶原蛋白及其温敏水凝胶。
技术介绍
温敏水凝胶是能够感受外界环境温度的变化从而转变成凝胶的智能材料。利用其在低温时是流动液体，达到一定温度即转化为凝胶的性质，通过调整相变温度与体温接近，即可得到用于人体可注射温敏水凝胶。这样的水凝胶在低温时容易与药物或细胞混合，成胶后又具有一定机械强度，近年来在药物缓释、组织修复方面有广泛的应用前景。现有技术对此也有研究，例如，中国专利申请CN103656749A公开了一种复合型可降解的抗菌人工硬脑膜及其制备方法，其中包含万古霉素或盐酸氧氟沙星注射液，壳聚糖及甘油磷酸钠，然而该专利中没有涉及胶原蛋白，也没有研究胶原蛋白在其中的影响。中国专利申请CN104971352A公开了一种眼用壳聚糖载药温敏水凝胶及其制备方法，其中需要聚乙烯醇，而且机械强度很弱。中国专利申请CN101297980A公开了含纳米羟基磷灰石/胶原微粒的骨修复材料及其制备方法，其中含纳米羟基磷灰石/胶原微粒、壳聚糖和甘油磷酸钠，其通过加入羟基磷灰石来增强机械强度。在现有技术无法预期的情况下，本专利技术人基于对温敏转变的理解和对机械强度影响因素的研究，开发了一种温敏水凝胶，其中使用的重组胶原蛋白分子量确定，无免疫原性，生物相容性好。另外，本专利技术人利用创新工艺将重组胶原蛋白、壳聚糖和甘油磷酸钠反应，无需米羟基磷灰石等，即产生了机械强度特别适合关节滑膜修复的温敏水凝胶。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供新的重组胶原蛋白和新的温敏水凝胶。另外，本专利技术还提供它们的制备方法和应用等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了重组人源胶原蛋白，其氨基酸序列a)如序列表中的SEQIDNO：1所示；或b)是对序列表中的SEQIDNO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。在第二方面，本专利技术提供了核酸分子，其编码本专利技术第一方面的重组人源胶原蛋白。在第三方面，本专利技术提供了载体，其含有本专利技术第二方面的核酸分子。载体优选是表达载体，更优选是酵母表达载体。在第四方面，本专利技术提供了宿主细胞，其含有本专利技术第二方面的核酸分子。宿主细胞可以通过转染或转导本专利技术第三方面的载体来制备。宿主细胞优选是酵母细胞。在第五方面，本专利技术提供了制备本专利技术第一方面的重组人源胶原蛋白的方法，其包括，用本专利技术第四方面的宿主细胞表达本专利技术第一方面的重组人源胶原蛋白，然后分离纯化所述重组人源胶原蛋白。在第六方面，本专利技术提供了温敏水凝胶，其由如下方法制备：(1)将壳聚糖溶解于酸性溶液中，透析后冷冻干燥，获得冷冻干燥产物；(2)将冷冻干燥产物与重组胶原蛋白混合溶解于水中，得到水溶液；(3)向水溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应，透析后冷冻干燥，获得反应产物；和，(4)反应产物加水溶解后加入含β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠的溶液，于37℃静置。其中，重组人源胶原蛋白优选是本专利技术第一方面的重组人源胶原蛋白。优选在本专利技术第六方面的温敏水凝胶中，在步骤(1)中，酸性溶液是乙酸水溶液，优选其中乙酸含量为0.05-0.2M；壳聚糖溶解于酸性溶液中所得溶液的壳聚糖含量为2-4％(w/w)；或，透析时间为3-7天。优选在本专利技术第六方面的温敏水凝胶中，在步骤(2)中，水溶液中壳聚糖含量为1-2％(w/w)；水溶液中重组胶原蛋白含量为2-4％(w/w)；或，水是去离子水。优选在本专利技术第六方面的温敏水凝胶中，在步骤(3)中，碳二亚胺的终浓度为5-30mM；N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为15-90mM；碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:3；反应的时间为1-6小时；反应的温度为室温；或，透析时间为3-7天。优选在本专利技术第六方面的温敏水凝胶中，在步骤(4)中，反应产物加水溶解后为2～5％(W/W)，优选为2～4％(W/W)；反应产物、β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠的重量比例为20～40：50～150：3～11；或，静置的时间为2～10分钟。在第七方面，本专利技术提供了本专利技术第六方面的温敏水凝胶的制备方法。优选地，本专利技术第七方面的制备方法包括如下步骤：(1)将壳聚糖溶解于酸性溶液中，透析后冷冻干燥，获得冷冻干燥产物；(2)将冷冻干燥产物与重组胶原蛋白混合溶解于水中，得到水溶液；(3)向水溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应，透析后冷冻干燥，获得反应产物；和，(4)反应产物加水溶解后加入含β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠的溶液，于37℃静置。更优选地，本专利技术第七方面的制备方法也优选本专利技术第六方面的各个优选的方面。在第八方面，本专利技术提供了本专利技术第六方面的温敏水凝胶在制备医用修复材料中的应用。优选在本专利技术第八方面的应用中，医用修复材料是关节滑膜修复材料。本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用重组人源胶原蛋白，与传统动物源胶原蛋白相比，其不存在潜在动物源疾病、异体排斥等问题，且易降解，无细胞毒性；本专利技术的温敏水凝胶所用材料与人体软骨接近，特别适合作为关节滑膜修复的材料；本专利技术具有适宜的微孔结构，能为细胞生长提供有利环境，从而作为血管或神经修复的支架。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本专利技术进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本专利技术范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本专利技术的范围内。具体实施方式以下本文将通过具体的实施例来描述专利技术。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)等实验手册中所列方法来实施；其中的试剂均可通过商业渠道获得。实施例1本专利技术的重组胶原蛋白的制备根据本专利技术人研究设计的重组胶原蛋白(其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示)，委托上海生工生物工程股份有限公司合成其编码基因并克隆入pPIC9K载体，电转化入Pichiapastoris酵母表达菌株GS115。将检测阳性的转化子经BMGY培养基培养24小时后，以10％(V/V)的量接种于发酵培养基(配方：甘油40g、K2SO418.2g、H3PO426.7ml、CaSO4.2H2O0.93g、MgSO414.9g、KOH4.13g，用水定容至1L)以29℃培养，控制溶氧为22～25％，培养4小时后，加入甲醇至终浓度0.5％(V/V)来诱导表达，于29℃继续振荡培养72小时，期间每隔24小时补加100％甲醇以保持甲醇的终浓度为0.5％(V/V)。发酵液取上清液电泳，经归一法计算，本专利技术的重组胶原蛋白的表达量为13g/L。发酵液过滤去除菌体和固体杂质，用中空纤维超滤膜浓缩脱盐，然后将浓缩液上样于用pH为5.0的10mM柠檬酸缓冲液平衡的CMSepharoseFF层析柱，用含0.5MNaCl的pH值为5.0的10mM柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，再，用中空纤维超滤膜浓缩脱盐，冷冻干燥浓缩液，即得本专利技术的重组胶原蛋白。实施例2本专利技术的温敏水凝胶的制备1将壳聚糖(北京百灵威科技有限公司，分子量分布100-300kDa)溶于0.1M乙酸溶液中，配制成质量浓度2％的溶液，加入透析袋透析3天后冷冻干燥。将冷冻干燥的壳聚糖和重组胶原蛋白混合溶解于去离子水中，其中壳聚糖和胶原蛋白的质量浓度分别为本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组胶原蛋白，其氨基酸序列a)如序列表中的SEQ ID NO：1所示；或b)是对序列表中的SEQ ID NO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.重组胶原蛋白，其氨基酸序列a)如序列表中的SEQIDNO：1所示；或b)是对序列表中的SEQIDNO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。2.核酸分子，其编码权利要求1所述的重组胶原蛋白。3.载体或宿主细胞，其含有权利要求2所述的核酸分子。4.制备权利要求1所述的重组胶原蛋白的方法，其包括，用权利要求3所述的宿主细胞表达权利要求1所述的重组胶原蛋白，然后分离纯化所述重组胶原蛋白。5.温敏水凝胶，其由如下方法制备：(1)将壳聚糖溶解于酸性溶液中，透析后冷冻干燥，获得冷冻干燥产物；(2)将冷冻干燥产物与重组胶原蛋白混合溶解于水中，得到水溶液；(3)向水溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应，透析后冷冻干燥，获得反应产物；和，(4)反应产物加水溶解后加入含β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠的溶液，于37℃静置。6.权利要求5所述的温敏水凝胶，其中在步骤(1)中，酸性溶液是乙酸水溶液，优选其中乙酸含量为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨树林，康肸，邓爱鹏，
申请(专利权)人：南京艾澜德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32