重组人源胶原蛋白及其人造角膜制造技术

技术编号:30795034 阅读:4 留言:0更新日期:2021-11-16 07:59
本发明专利技术提供了一种重组人源胶原蛋白及其人造眼角膜。另外,本发明专利技术还提供了该人造眼角膜的制备方法及其应用等。膜的制备方法及其应用等。

【技术实现步骤摘要】
重组人源胶原蛋白及其人造角膜


[0001]本专利技术属于生物医药与生物材料
,更具体地,本专利技术涉及重组人源胶原蛋白及其人造眼角膜。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是动物体内含量最丰富的一类结构蛋白质。胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能,能参与细胞的迁移、分化和增殖,使结缔组织具有机械强度,同时胶原蛋白还能促进细胞生长,具有良好的生物相容性与可生物降解的特性。基于这些特性,胶原蛋白在烧创伤修复、眼角膜疾病治疗、创面止血、药物传递与缓释、矫形、保健、美容等医疗卫生领域有广泛应有。常见的胶原蛋白是从牛骨、牛皮、鱼鳞、鱼皮、猪皮等动物组织中分离提取而来,存在动物病毒隐患、应用于人体时会产生异体或异种的排异反应且分子量不确定、分布范围广等缺点和不足。本专利技术人的前期研究成果很好的克服了这些缺陷:利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。该重组胶原是以III型胶原为模板,体外构建六串联序列并连入pPIC9K形成类人胶原蛋白基因六串联体表达载体pPIC9KG6。将该表达载体导入毕赤酵母后进行高密度发酵,并通过分离纯化,得到高纯度重组Ⅲ型人源胶原蛋白RHC,作为本专利技术的首选原料。
[0003]目前全球每年有超过400,000例角膜致盲病例,原因是外伤或感染造成的角膜疤痕,这类病例可通过手术植入的生物工程角膜进行治疗。治疗方法包括人供体角膜移植或使用从转基因猪身上采集的角膜组织。然而,人供体角膜严重短缺,猪角膜存在光学透明度和耐久性不足的问题,这两种方法都需要额外的免疫抑制药物来防止移植排斥。人III型胶原是一种存在于正常人角膜中的关键结构蛋白。利用人III型胶原制成的生物合成角膜光学透明,可替代上述治疗方法,并无需使用免疫抑制药物。
[0004]壳聚糖,也称几丁质,是甲壳素的去乙酰化产物,甲壳素是节肢动物和真菌中最主要的结构生物高分子。它存在于甲壳类动物、真菌和酵母的细胞壁以及昆虫的外骨骼中。壳聚糖主要由螃蟹、虾或其他海洋甲壳类动物的壳中提取。壳聚糖拥有良好的生物相容性、降解速率以及一定的抗菌和创伤愈合作用,此外壳聚糖还被证明有优良的凝血性能和组织修复功能,因此壳聚糖被广泛地应用于止血、创伤敷料、骨修复和神经修复等领域。其中,壳聚糖的羧甲基产物(CMCS)具备良好的水溶性,在制备过程中可以不涉及有机酸溶剂,因此作为本专利技术的首选原料。
[0005]水凝胶作为一种不溶于水但有很强亲水性的柔性高分子材料,其分子具有独特的三维立体网络状构型并保持一定的形状。水凝胶作为一类高保水、生物相容性佳的仿生生物功能材料,长期以来一直用于组织工程支架材料的开发。而眼角膜属于软组织,同时大量含水,胶原基水凝胶的特性与角膜ECM高度相似,并具有较高的生物相容性,因此胶原基水凝胶是一种作为角膜替换、角膜修复、软性角膜接触镜(隐形眼镜)、硬性角膜接触镜(隐形眼镜)、角膜细胞体外培养及眼部缓释药物载体的优选生物材料。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供新的重组胶原蛋白和新的角膜。另外,本专利技术还提供它们的制备方法和应用等。
[0007]具体而言,在第一方面,本专利技术提供了重组人源胶原蛋白,其氨基酸序列
[0008]a)如序列表中的SEQ ID NO:1所示;或
[0009]b)是对序列表中的SEQ ID NO:1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。
[0010]在第二方面,本专利技术提供了核酸分子,其编码本专利技术第一方面的重组人源胶原蛋白。
[0011]在第三方面,本专利技术提供了载体,其含有本专利技术第二方面的核酸分子。载体优选是表达载体,更优选是酵母表达载体。
[0012]在第四方面,本专利技术提供了宿主细胞,其含有本专利技术第二方面的核酸分子。宿主细胞,其含有本专利技术第二方面的核酸分子。宿主细胞可以通过转染或转导本专利技术第三方面的载体来制备。宿主细胞优选是酵母细胞。
[0013]在第五方面,本专利技术提供了制备本专利技术第一方面的重组人源胶原蛋白的方法,其包括,用本专利技术第四方面的宿主细胞表达本专利技术第一方面的重组人源胶原蛋白,然后分离纯化所述重组人源胶原蛋白。
[0014]在第六方面,本专利技术提供了人造角膜,其由包括如下步骤的方法制备:
[0015](1)分别配制重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液、壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸或水溶液、EDC与NHS水溶液和β

甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液;
[0016](2)将重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液与壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸水或水溶液混合均匀,制得第一混合溶液;
[0017](3)将EDC与NHS水溶液、与第一混合溶液混合均匀,任选加入光引发剂,制得第二混合溶液;
[0018](4)将β

甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液与第二混合溶液混合均匀,并置于模具内固化成型,得到人造角膜;和
[0019](5)任选将人造角膜取出并保存于磷酸盐缓冲液中。
[0020]在本文中,“任选”具有其词典意义,表明可以选择,也可以不选。例如,可以不加入光引发剂,则步骤(3)为:将EDC与NHS水溶液、与第一混合溶液混合均匀,制得第二混合溶液。
[0021]在本文中,如未特别指出,所有制备操作均在室温无菌环境下进行,所需原料、试剂和仪器也是无菌的。
[0022]在本文中,所使用的重组胶原蛋白的类型可为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、













与G

X

Y重复序列型或其他小分子量胶原;重组胶原蛋白可来自微生物表达系统(大肠杆菌、链球菌、汉森酵母、酿酒酵母、毕赤酵母等)、哺乳动物表达系统(转基因鼠、人胚肾上皮细胞等)、昆虫表达系统(昆虫细胞、转基因蚕等)和植物表达系统(转基因烟草、大麦种子、玉米等);所使用的重组胶原蛋白分子量为2~500Kd。
[0023]优选在本专利技术第六方面的人造角膜中,重组胶原蛋白优选为重组人源胶原蛋白。例如,本专利技术的重组人源胶原蛋白可以是中国专利ZL 200610098297.5所公开的方法获得
的重组人源胶原蛋白,更优选的是,通过中国专利ZL201110327865.5提供的高密度发酵和纯化方法,利用通过不同重复数同向串联基因重组质粒所构建的巴氏毕赤酵母基因工程菌(菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC NO.5021)而生产的重组人源胶原蛋白。人源胶原蛋白比起动物(尤其是非哺乳动物)胶原蛋白而言,对人体的使用安全性更为可靠。
[0024]在本文中,成型方式包括静置成型、离心浇铸、铸模成型(模压)法、3D打印等。
[0025]优选在本专利技术第六方面的人造角膜中,甲基丙烯酸化重组胶原蛋白由包括如下步骤的方法制备:
[0026](a)将重组胶原蛋白溶于磷酸缓冲本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组胶原蛋白,其氨基酸序列a)如序列表中的SEQ ID NO:1所示;或b)是对序列表中的SEQ ID NO:1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。2.核酸分子,其编码权利要求1所述的重组Ⅲ型人源胶原蛋白。3.载体或宿主细胞,其含有权利要求2所述的核酸分子。4.制备权利要求1所述的重组胶原蛋白的方法,其包括,用权利要求3所述的宿主细胞表达。5.人造角膜,其由包括如下步骤的方法制备:(1)分别配制重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液、壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸或水溶液、EDC与NHS水溶液和β

甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液;(2)将重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液与壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸水或水溶液混合均匀,制得第一混合溶液;(3)将EDC与NHS水溶液、与第一混合溶液混合均匀,任选加入光引发剂,制得第二混合溶液;(4)将β

甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液与第二混合溶液混合均匀,并置于模具内固化成型,得到人造角膜;和(5)任选将人造角膜取出并保存于磷酸盐缓冲液中。6.权利要求5所述的人造角膜,其中,甲基丙烯酸化重组胶原蛋白由包括如下步骤的方法制备:(a)将重组胶原蛋白溶于磷酸缓冲液中,制得胶原蛋白磷酸盐溶液;(b)向胶原蛋白磷酸盐溶液加入甲基丙烯酸酐,进行反应,优选反应45~75分钟;(c)将步骤(b)得到的反应液离心,取上清液稀释并透析;和(d)任选进行冷冻干燥。7.权利要求5所述的人造角膜,其中步骤(1)中,重组胶...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨树林王子勋朱帅
申请(专利权)人:南京艾澜德生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:

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