重组胶原蛋白及其双层人造血管支架制造技术

本发明专利技术提供了胶原蛋白，可用于作为血管支架的的原料。本发明专利技术还提供了双层人造血管支架及其制备方法，包括将胶原蛋白、聚已内酯、聚氧化乙烯等按一定流程制备的过程。

Recombinant collagen and its double-layer vascular stent

【技术实现步骤摘要】
重组胶原蛋白及其双层人造血管支架
本专利技术属于多肽技术和生物医学材料领域，具体而言，本专利技术涉及重组胶原蛋白及其双层人造血管，具有良好的生物相容性，抗渗透性，柔韧性和一定的力学性能。
技术介绍
胶原蛋白是细胞外基质的主要组成成分，也是动物体内含量最多的蛋白，所有的多细胞动物都含有丰富的胶原，因此胶原蛋白具有良好的生物相容性。胶原蛋白具有独特的组织结构和生物功能，对维护细胞，组织，器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用及其具有较大的亲和力，良好的生物降解安全性，可降解吸收，作为一种性能优良的生物材料，已经得到广泛的应用在医学领域。常见的胶原蛋白是从牛骨、牛皮、鱼鳞、鱼皮、猪皮等动物组织中分离提取而来，存在动物病毒隐患、应用于人体时会产生异体或异种的排异反应且分子量不确定、分布范围广等缺点和不足。本专利技术人的前期研究成果很好的克服了这些缺陷：利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。由于本专利技术的胶原蛋白是一种纤维状蛋白，并能与体能蛋白多糖、糖蛋白等成分结合，因而使其加工工艺复杂困难。本专利技术人通过前期研究，在中国专利申请第201710933005.3号中，公开了一种重组胶原蛋白温敏水凝胶，其通过加入壳聚糖、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠等成分制备而得，具有良好的温敏转变性质和机械强度，特别适用于关节滑膜的修复。心血管疾病是当今世界威胁人类健康严重的疾病之一，其发病率和死亡率均超过肿瘤性疾病而跃居第一位。患者通常是由于血管的病变导致人体部分血管无法进行正常供血，血管狭窄或者栓塞，若得不到及时的治疗，将会引起患者瘫痪或者死亡，从而危害人体健康。目前治疗上述疾病通常的方法包括血管重建，搭桥或移植手术。其中血管手术大多数来源自体血管作为替代品，来源受到限制严重不足。因此，理想的人造血管支架越来越高的数量要求。目前，纺丝型人造血管支架已广泛地应用于临床，替换人体内已坏损的血管，并取得了较好的治疗效果。然而，现有技术并没有将该胶原蛋白用于制备人造血管支架，尤其是没有将该胶原蛋白用于采用静电纺丝技术来制备人造血管支架的教导。静电纺丝技术工艺的原理是利用高电压静电场的作用来实现纺丝液的喷射，喷射过程中，溶剂挥发，高压电源在喷头处加载正向高压此时高压电源在喷头处加载正向高压，溶液喷头形成泰勒锥(Taylorcone)。在电放丝过程中，通过调节和控制纺丝参数，如纺丝液的浓度，电压，针头，转速，纺丝距离等，纤维结构，形貌和组成能得到有效的优化。例如，中国专利申请CN109248340A公开了一种纤维基人造血管的制备方法，将聚已内酯和聚氨酯的混合溶液成丝卷绕，在卷绕层上用N,N-二甲基甲酰胺进行喷涂得到溶剂层；将其作为静电纺丝接收端，进行静电纺丝得到静电纺丝层，在静电纺丝层上用N,N-二甲基甲酰胺进行喷涂，按顺序重复一次上述步骤，得到纤维基人造血管。中国专利申请CN105232184A公开了一种人造血管及其制备方法和喷头装置，将裁减并缝合成圆筒形的织物作为血管外层管壁，置于金属管内腔，向其内层进行静电纺，从而形成具有双层管壁的人造血管。然而这种人造血管在缝合过程中会出现缝合张力不匀，缝合均匀度差，缝合空洞过大，从而造成覆膜支架在体内疲劳失效。本专利技术人没有受现有技术的限制，凭借长期研究的经验并经过艰苦的努力，在精心研究了本专利技术提供的重组胶原蛋白的性质的前提下，从天文数字般的辅料中令人意外地发现了一种配方，并由此设计了适用的制备流程，从而获得本专利技术的双层人造血管支架，其具有紧密纳米纤维的内层膜和具有多孔结构和适宜孔隙率的外层膜，有利于细胞向其内部长入，促进细胞的增长与迁移。。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供重组胶原蛋白及其在制备双层人造血管支架中的应用等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了重组胶原蛋白，其氨基酸序列a)如序列表中的SEQIDNO：1所示；或b)是对序列表中的SEQIDNO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。在第二方面，本专利技术提供了核酸分子，其编码本专利技术第一方面的重组胶原蛋白。在第三方面，本专利技术提供了载体，其含有本专利技术第二方面的核酸分子。载体优选是表达载体，更优选是酵母表达载体。在第四方面，本专利技术提供了宿主细胞，其含有本专利技术第二方面的核酸分子。宿主细胞可以通过转染或转导本专利技术第三方面的载体来制备。宿主细胞优选是酵母细胞。在第五方面，本专利技术提供了制备本专利技术第一方面的重组胶原蛋白的方法，其包括，用本专利技术第四方面的宿主细胞表达本专利技术第一方面的重组胶原蛋白，然后分离纯化所述重组胶原蛋白。在第六方面，本专利技术提供了双层人造血管支架，其由如下方法制备：(1)将聚已内酯的六氟异丙醇溶液和重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液混合，得到纺丝溶液；(2)用步骤(1)获得的纺丝溶液进行纺丝，得到内层纤维层；(3)将步骤(2)获得的内层纤维层加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液中交联，任选进行清洗和干燥，得到内层；和(4)以步骤(3)获得的内层为基底，用聚氧化乙烯溶液和聚已内酯的六氟异丙醇溶液进行纺丝，包裹在基底上形成外层，然后溶解掉聚氧化乙烯，得到双层人造血管支架。在本文中，重组胶原蛋白可以是重组人源胶原蛋白。例如，本专利技术的重组人源胶原蛋白可以是中国专利ZL200610098297.5所公开的方法获得的重组人源胶原蛋白，更优选的是，通过中国专利ZL201110327865.5提供的高密度发酵和纯化方法，利用通过不同重复数同向串联基因重组质粒所构建的巴氏毕赤酵母基因工程菌(菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.5021)而生产的重组人源胶原蛋白。人源胶原蛋白比起动物(尤其是非哺乳动物)胶原蛋白而言，对人体的使用安全性更为可靠。在本专利技术的一个具体实施方式中，重组胶原蛋白优选是本专利技术第一方面的重组胶原蛋白。优选在本专利技术第六方面的双层人造血管支架中，内层与外层的厚度比为0.5:1～0.5:1.5。也优选在本专利技术第六方面的双层人造血管支架中，聚已内酯的六氟异丙醇溶液的浓度为11～15wt％。还优选在本专利技术第六方面的双层人造血管支架中，重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液的浓度为6～10wt％。另外优选在本专利技术第六方面的双层人造血管支架中，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的80～100％(V/V)乙醇溶液，更优选1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液的浓度为2.5～3.5mM。还优选在本专利技术第六方面的双层人造血管支架中，聚氧化乙烯溶液是聚氧化乙烯的80～100％(V/V)乙醇溶液，更优选聚氧化乙烯溶液的浓度为4～6wt％。另外还优选在本专利技术第六方面的双层人造血管支架中，在步骤(1)中，聚已内酯的六氟异丙醇溶液和重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液的体积比为3：1～1：3。本专利技术人发现，接收距离优选为10-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组胶原蛋白，其氨基酸序列/na)如序列表中的SEQ ID NO：1所示；或/nb)是对序列表中的SEQ ID NO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.重组胶原蛋白，其氨基酸序列
a)如序列表中的SEQIDNO：1所示；或
b)是对序列表中的SEQIDNO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。


2.核酸分子，其编码权利要求1所述的重组胶原蛋白。


3.载体或宿主细胞，其含有权利要求2所述的核酸分子。


4.制备权利要求1所述的重组胶原蛋白的方法，其包括，用权利要求3所述的宿主细胞表达权利要求1所述的重组胶原蛋白，然后分离纯化所述重组胶原蛋白。


5.双层人造血管支架，其由如下方法制备：
(1)将聚已内酯的六氟异丙醇溶液和重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液混合，得到纺丝溶液；
(2)用步骤(1)获得的纺丝溶液进行纺丝，得到内层纤维层；
(3)将步骤(2)获得的内层纤维层加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液中交联，任选进行清洗和干燥，得到内层；和
(4)以步骤(3)获得的内层为基底，用聚氧化乙烯溶液和聚已内酯的六氟异丙醇溶液进行纺丝，包裹在基底上形成外层，然后溶解掉聚氧化乙烯，得到双层人造血管支架。


6.权利要求5所述的双层人造血管支架，其中，
内层与外层的厚度比为0.5:1～0.5:1.5；
聚已内酯的六氟异丙醇溶液的浓度为11～15wt％；
重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液的浓度为6～10wt％；
1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的80～100％(V/V)乙醇溶液，优选1-乙基-3-(3-二...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨树林，杜诗梅，邓爱鹏，
申请(专利权)人：南京艾澜德生物科技有限公司，杨树林，
类型：发明
国别省市：江苏;32