零背景构建重组杆状病毒的方法技术

本发明专利技术是一种零背景构建重组杆状病毒的方法。具体步骤为：（１）构建以Ｒ６Ｋγ作为复制子的供体质粒，并按常规方法引入外源基因；（２）封闭ＤＨ１０Ｂａｃ宿主菌基因组上的ａｔｔＴｎ７受体位点，获得ＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７；（３）常规方法转化重组供体质粒进入ＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７获得重组杆状病毒；（４）常规方法制备重组Ｂａｃｍｉｄ　ＤＮＡ转染昆虫细胞。本发明专利技术利用以Ｒ６Ｋγ为复制子构建条件限制型供体质粒，同时封闭ＤＨ１０Ｂａｃ宿主菌基因组上的ａｔｔＴｎ７重组位点，只需常规转化即可获得重组杆状病毒，并且由于其超过９９％的阳性重组率，无须复杂的ＰＣＲ验证和繁琐的空斑纯化，做到零背景真正高效快速的构建重组杆状病毒，促进杆状病毒表达系统的广泛利用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和蛋白工程领域，具体是一种零背景构建重组杆状病 毒的方法。
技术介绍
昆虫杆状病毒表达系统是20世纪80年代发展起来的真核表达系统，它具 备所有真核表达系统翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化、磷酸化、信 号肽切除等，表达出的重组蛋白具有天然蛋白的生物学功能。Smith等(1983) 用苜宿银纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(AcMNPV,Xwtograp/za c^/orm'ca multiple nudeocapsid nucleopolyhedrovims)作载体在草地夜蛾细胞Sf-21中高 效表达人卩-干扰素的研究成果开拓了杆状病毒作为载体表达外源基因的新领 域。目前，利用杆状病毒表达系统表达外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、 动物和植物等各种生物，其应用范围涉及蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质 之间相互作用方面的基础研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良 等。杆状病毒由于基因组庞大，外源基因的克隆不能象细菌或酵母载体一样通 过酶切连接的方式直接插入，而必须通过转移载体的介导。因此如何高效快速 地构建重组杆状病毒成为利用杆状病毒表达外源基因的最关键一歩。目前构建重组杆状病毒方法有传统的昆虫细胞内同源重组，细菌内重组即 Bac-to-Bac系统，以及直接连接等三种方式。其中昆虫细胞内同源重组和直接 连接由于重组效率低，转座背景高，需要多轮空斑纯化，耗时费力，现在己经 很少有研究者使用。目前最常用的杆状病毒表达系统是细菌内重组即 Bac-to-Bac系统，其本质上是将NPV基因组DNA改造成可在细菌内复制并能 与供体质粒在细菌内发生转座且同时对昆虫细胞保留感染性的大型穿梭载体。 其转座原理基于Tn7转座子的专一位点转座系统，它通过将杆状病毒DNA改 造成可在大肠杆菌菌株中复制的Bacmid载体，即在杆状病毒基因组中含有可 在大肠杆菌复制的F因子复制子，卡那霉素抗性基因，Tn7转座接触位点以及 lacZ'盒式结构，由于杆状病毒基因组为环状闭合双链DNA分子，因此这种 Bacmid可以像质粒一样在大肠杆菌中以低拷贝形式复制。而在转移载体中外源基因位于多角体启动子的驱动下，两端分别为Tn7转座子的左、右端转座序 列，当将重组转移载体转化到含有Bacmid的大肠杆菌中后，在辅助质粒提供 的转座酶的介导下进行转座，将重组转移载体上含外源基因的表达盒式结构转 座到Bacmid的lacZ'盒式结构中，破坏a互补，因此重组病毒可以通过简单 的蓝白斑方法筛选，从白色菌落中分离的重组病毒DNA直接转染昆虫细胞即可 以获得有感染性的重组病毒粒子。然而即使是Bac-to-Bac系统，虽然其不需要在昆虫细胞内进行同源重组， 但在细菌内转座效率也不是非常高，通常只10%左右的白斑，而且白斑菌落 需要进一步划线培养和PCR验证以去除假阳性，比较耗时复杂。现有方法基本 能够满足在构建单个或者少量重组病毒，一旦需要构建数十个甚至更多的重组 病毒大量表达外源基因时则效率太低。而且由于获得重组病毒的效率少于90 % ，不合适构建高质量库容量大的杆状病毒cDNA文库。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，可去除转座中 的背景干扰，避免复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，真正做到高效快速构建 重组杆状病毒。本专利技术所述的按下述步骤实现(1)构建以R6KY作为复制子的供体质粒，并按常规方法引入外源基因；(2)封闭 DH10Bac宿主菌基因组上的诚Tn7受体位点，获得DH10BacATn7; (3)常 规方法转化重组供体质粒进入DH10BacATn7获得重组杆状病毒；(4)常规 方法制备重组Bacmid DNA转染昆虫细胞。本专利技术供体质粒以R6Ky作为复制子，DH10BacATn7中封闭了宿主菌 上的加汀n7受体位点，两种策略的单独使用都可以提高转座效率。本专利技术的理论依据Bacmid宿主菌五.co/z'DH10B基因组内存在有Tn7转 座受体位点(a"Tn7)，这些受体位点会与Bacmid中的a"Tn7竞争，造成目标 转座效率下降；另一方面以pUC为基本骨架的转移载体和具有F因子复制子 的Bacmid在宿主菌中可以共存，使得抗性筛选背景非常高，增加了获得重组 病毒的程序和时间。R6KY复制子的复制依赖于宿主菌戸> 基因的表达产物Rep蛋白兀，如果在转移载体中利用R6KY作为复制子，这样就可以避免转移载体 以质粒的形式和Bacmid在宿主菌中共存的问题，减少抗性筛选背景；封闭宿 主菌基因组中的a^Tn7位点，就避免了这些受体位点与Bacmid中的a"Tn7 竞争，解决了目标转座效率下降的问题。 有益效果本专利技术利用以R6KY为复制子构建条件限制型供体质粒，同时封闭 DH10Bac宿主菌基因组上的加Tn7重组位点，只需常规转化即可获得重组杆 状病毒，并且由于其超过99%的阳性重组率，无须复杂的PCR验证和繁琐的 空斑纯化，做到零背景真正高效快速的构建重组杆状病毒，促进杆状病毒表达 系统的广泛利用。附图说明图l是供体质粒结构示意图，pRCDM含有R6Ky复制子，两个杆状病毒 强启动子(pl0和polh)，两个多克隆位点(MCS1和MCS2)以及转座同源臂 (Tn7L和Tn7R)。图2是封闭宿主菌基因组中Tn7受体位点的质粒 R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R结构示意图，该质粒含有FLP/FRT重组序列 (FRT-L和FRT-R)， Tn7重组序列(Tn7-L和Tn7-R)以及两个抗性筛选标记 (Zeocin禾卩chloramphenicol)。图3是pRCDM-gfj)转座BmDH10BacATn7后重组病毒的鉴定。以M13 通用引物PCR扩增重组杆状病毒，12个单克隆都扩增出大约3100bp的条带。图4是重组杆状病毒BmBacmid-g*感染BmN细胞。其中(A)是使用 488nm荧光观察感染72小时后的BmN细胞，(B)是同一视野下普通光观察 感染72小时后的BmN细胞。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应当说明的是，这些实施例仅 用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术要求的保护范围，下列实施例中未注明具 体实验条件和方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；孙明主编，高等教育出版社，2006，基因工程(第十七章，病毒基因工程，姚伦广编著)；黎路林编著，华中师范 大学出版社，1996，杆状病毒表达载体系统，或按照制造厂商的操作指南所建 议的方法进行。实施例1:零背景获得重组BmBacmid的方法 (1)供体质粒的构建如图1所示，该质粒以R6K，ri为条件限制型复制子，在表达/7/r基因的 菌株中才能复制繁殖。具体构建过程如下以pUCDM (T.J.Richmond赠送) 为模板，上游弓I物R6K，F: ggcgcgccTAGGGATAACAGGGTAATGAGCTCC GTGG GCCCAATTCTGTCA,下游弓I物R6Ky-R:ggcgcgccTAGGGATAACAGG GTAATT CGAAACGCGCTAGTATAATTTAAC (划线部分为Asc I酶切位点)， 扩增R6Ky复制子。Zeocin基因以pVgRxR (购本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种零背景构建重组杆状病毒的方法，其特征在于：该构建方法按下列步骤进行：　（１）构建以Ｒ６Ｋγ作为复制子的供体质粒，并按常规方法引入外源基因；　（２）封闭ＤＨ１０Ｂａｃ宿主菌基因组上的ａｔｔＴｎ７受体位点，获得ＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７；　（３）常规方法转化重组供体质粒进入ＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７获得重组杆状病毒；　（４）常规方法制备重组Ｂａｃｍｉｄ　ＤＮＡ转染昆虫细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张二辉，姚伦广，孙京臣，刘宗才，张红玲，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]