本发明专利技术涉及一种ＢｍＮＰＶ－家蚕幼虫多基因表达系统构建方法，按下列步骤顺序完成：（１）将阿拉伯糖启动子（ｐＢＡＤ）控制的Ｉ－ＳｃｅＩ表达盒重组到Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ的基因组中获得新的受体菌Ｉ－ＳｃｅＩ ＤＨ１０Ｂ；（２）结合转移用供体质粒的构建；（３）ｃｒｅ／ｌｏｘｐ重组位点取代ＢｍＢａｃｍｉｄ基因组中的ｖ－ｃａｔｈ和ｃｈｉｔｉｎ基因，２个Ｉ－ＳｃｅＩ位点取代ＢｍＢａｃｍｉｄ中的ｐ７０基因获得受体Ｉ－ｓｃｅＩ ＢｍＭｕｌｔｉｂａｃ；（４）利用ｃｒｅ－ｌｏｘｐ重组、Ｔｎ７重组和结合转移三种方法引入外源基因；（５）常规方法制备重组Ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ并转染昆虫细胞或者注射家蚕幼虫。本发明专利技术获得ＢｍＮＰＶ－家蚕幼虫多基因表达系统，为研究多亚基蛋白、蛋白与蛋白之间相互作用以及制备病毒样颗粒奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和蛋白工程领域，具体涉及一种BmNPV—家蚕幼虫 多基因表达系统的构建方法。
技术介绍
因为具有对人及哺乳动物安全、超强的多角体启动子(polh)驱动外源基因 在昆虫细胞内高效表达、昆虫细胞培养方便、病毒操作简单、克隆外源片段能 力大(30-50kb)、表达产物具有正确后加工等特点，杆状病毒表达系统(BES， Baculovirus Expresson System)已经成为表达真核生物基因的优秀表达系统之 -。目前，利用杆状病毒表达系统表达外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、 动物和植物等各种生物，其应用范围涉及蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质 之间相互作用方面的基础研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良 等。目前主要使用两种杆状病毒表达系统， 一种为商业化的AcNPV-sf9或者 AcNPV-High5系统，该系统利用重组AcNPV在离体培养细胞sf9或者High5 中进行外源基因表达。另外一种就是BmNPV (家蚕核型多角体病毒)-家蚕 幼虫表达系统，该系统利用重组BmNPV在家蚕活体内进行蛋白表达。家蚕饲养 在我国具有悠久的历史，其培养方式简单，成本较低，其成本为细胞培养的 1/10，而蛋白表达量则为培养细胞的IO倍左右，因此BmNPV —家蚕幼虫表 达系统在经济高效大量表达外源蛋白方面具有极为诱人的前景和优势。但是BmNPV-家蚕幼虫表达系统也有其缺点由于转移载体大小局限性， 一个供体质粒最多只能携带4个外源基因表达盒，对于使用BmNPV-家蚕幼 虫表达系统同时表达多个外源基因有很大的局限性。以生产病毒样颗粒(VLPs) 为例，在昆虫细胞中通过表达2个以上的病毒结构蛋白获得VLPs —般有两种 策略其一是构建数个不同的重组杆状病毒，每个杆状病毒表达一个结构基因， 再使用几种重组杆状病毒同时感染细胞，让同一细胞内同时表达几个结构蛋 白，再自我组装成VLPs。另外一种方法就是通过携带多个启动子的供体质粒， 同时将多个目的基因克隆到NPV基因组中，只需要一种重组杆状病毒感染昆虫细胞即可表达几个目的蛋白，然后再组装成VLPs.早期多以前一种方式为 主，该方法操作比较繁琐，需要构建几个重组杆状病毒，在感染过程中因难以保证多个杆状病毒同时进入每一个细胞，可能会造成VLPs组装量较少。随着 构建重组杆状病毒技术的发展，尤其同时克隆多个(2 4)表达盒技术的出现， 目前多使用后一种技术获得VLPs，其操作相对简单，VLPs产出量较高，但 由于BmNPV-家蚕幼虫表达系统在多基因表达方面的局限性，限制了使用其 生产VLPs的广泛利用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种BmNPV —家蚕幼虫多基因表达系统的构建方 法，可引入多个基因到BmBacmid中，在家蚕细胞或幼虫中实现高效经济表 达多个基因或者蛋白复合物，特别是为BmNPV-家蚕幼虫生产病毒样颗粒 (VLPs)提供基础。本专利技术BmNPV —家蚕幼虫多基因表达系统构建方法按下述步骤实现 (1)将阿拉伯糖启动子(pBAD)控制的I-Scel表达盒重组到DH10B的 基因组中获得新的受体菌I-Scel DH10B; (2)结合转移用供体质粒的构建； (3) Cre/loxp重组位点取代BmBacmid基因组中的v-caA和基因，2个 I-Scel位点取代BmBacmid中的/ 70基因获得受体I-scelBmMultibac; (4)利 用cre-loxp重组、Tn7重组和结合转移三种方法引入外源基因；(5)常规方法 制备重组BacmidDNA并转染昆虫细胞或者注射家蚕幼虫。本专利技术的理论依据细菌间结合转移能够方便地实现DNA在细菌间的传 递，转移载体进入受体细菌后可以通过诱导受体细菌表达归位酶将载体线性 化，同时表达重组酶将目的片段重组到合适的受体中，从而获得重组杆状病毒。 Cre/loxp和Tn7特异性重组作为两种不同的重组方式，在各自辅助酶的帮助下 实现同源重组，获得重组杆状病毒。这三种获得重组杆状病毒的方式不同，三 者之间没有相互影响，结合使用可以实现BmNPV-家蚕幼虫的多基因表达。有益效果本专利技术同时利用cre-loxp重组位点、Tn7重组位点和结合转移三种方法引 入外源基因可以实现BmNPV-家蚕幼虫的多基因表达。本专利技术获得BmNPV-家蚕幼虫多基因表达系统，不但可以实现单个基因多拷贝数的表达，还可以同时表达多达12个外源基因，为研究多亚基蛋白、蛋白与蛋白之间相互作用以 及制备病毒样颗粒奠定基础。附图说明图1是供体质粒pHTdual示意图。该质粒含有顺式激活元件oriT负责质粒pHTdual的转移，PplO和Ppolh两个杆状病毒强启动子，能同时驱动2个目的基因表达。图2是三种方式构建多基因表达重组杆状病毒流程图。图3是利用可变模块将4一6个基因同时克隆到转移载体示意图。图4是携带双荧光报告基因重组杆状病毒在BmN细胞中的表达，其中(A)是使用488nm激光观察感染72小时后的BmN细胞，(B)是同一视野下512nm激光观察感染72小时后的BmN细胞。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一歩阐述本专利技术。应当说明的是，这些实施例仅 用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术要求的保护范围，下列实施例中未注明具 体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；孙明主编，高等教育出版社，2006， 基因工程(第十七章，病毒基因工程，姚伦广编著)；黎路林编著，华中师范 大学出版社，1996，杆状病毒表达载体系统，或按照制造厂商的操作指南所建 议的方法进行。实施例1:构建杆状病毒-家蚕幼虫多基因表达系统的方法 (1)供体质粒的构建如图1所示，顺式激活元件oriT来原于F因子，负责供体质粒的转移。 具体构建过程如下Zeocin抗性基因(Em7-ZeoR)经PCR扩增而来，其两 段分别加上了 2个同源臂序列(HL和HR)， 2个I-Scel位点，以及BstBI，SacI， pmeI,AvrII等酶切位点。其上下游引物分别为ZeoR-F: 5'-TTCGAATAGGGCATTTGAGGATGCAGCACGTGTTGACAA-3，； ZeoR隱R : 5，-GAGCTCTAGGTTTCATTATGTTTAAACCCTAGGAGGTCGACCCCCCTC-3，。 PCR产物首先 克隆T载体获得重组pSimple-Em7zeo，然后Ncol /Sail双酶切去掉Zeocin编 码区，保留Em7启动子。回收后的载体和来源于相同酶切pCohygro产物 hygromycin编码区相连，获得Em7启动子驱动的hygromycin表达盒。双酶切 后，该Em7-Hygromycin片段与经同样双酶切pMAGICI的R6kori+oriT产物进 行连接，获得中间过渡载体pHTdual-prel。 pmel/Avrll双酶切pFBDM获得含 p10和polh启动子片段，将该片段与pmel/Avrll酶切的pHTdual-prel相连， 获得结合转移载体pHTdual。(2) 受体菌I-ScelDH10B构建首先将可诱导阿拉伯糖启动子驱动的I-Scel表达盒引进DH10B基因组 中。质粒pML1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＢｍＮＰＶ－家蚕幼虫多基因表达系统构建方法，其特征在于：该构建方法按下列步骤顺序完成： （１）将阿拉伯糖启动子（ｐＢＡＤ）控制的Ｉ－ＳｃｅＩ表达盒重组到Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ的基因组中获得新的受体菌Ｉ－ＳｃｅＩ ＤＨ１０Ｂ； （２）结合转移用供体质粒的构建； （３）ｃｒｅ／ｌｏｘｐ重组位点取代ＢｍＢａｃｍｉｄ基因组中的ｖ－ｃａｔｈ和ｃｈｉｔｉｎ基因，２个Ｉ－ＳｃｅＩ位点取代ＢｍＢａｃｍｉｄ中的ｐ１０基因获得受体Ｉ－ｓｃｅＩ ＢｍＭｕｌｔｉｂａｃ； （４）利用ｃｒｅ－ｌｏｘｐ重组、Ｔｎ７重组和结合转移三种方法引入外源基因； （５）常规方法制备重组Ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ并转染昆虫细胞或者注射家蚕幼虫。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚伦广，张二辉，孙京臣，阚云超，刘宗才，刘飞，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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