一种提高家蚕幼虫体重量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高家蚕幼虫体重量的方法。从五龄家蚕丝腺中提取总RNA，逆转录获得第1链cDNA，并以其为模板Rt-PCR扩增，克隆获得BmCrzR cDNA，并以其为模板PCR扩增，酶切后将DNA片段连接载体获得pFLAG-BmCrzR，再以其为模板PCR扩增获得反应模板，将反应模板与T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液和T7酶混合反应并进一步处理得到BmCrzR dsRNA；最终将BmCrzR dsRNA注射入四龄家蚕幼虫腹部，桑叶饲养，五龄家蚕体重增加。本发明专利技术方法提高家蚕幼虫体重量，是没有增加蚕食桑量，通过调控家蚕代谢来实现的，这对于研究家蚕的物质与能量代谢机制、进一步提高家蚕经济性状和生理机能以及传统养蚕产业的技术革新等，具有积极作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及了一种提高蚕重量的方法，尤其是涉及了一种提高家蚕幼虫体重量的 方法。
技术介绍
家蚕（Bombyx mori)是当今地球上室内饲养量最大的经济资源昆虫，它从桑叶 (饲料）中摄取各种营养物质，并通过代谢生理过程供给蚕体内各个组织器官而进行生长、 发育、繁殖等。家蚕大规模饲养分为蚕茧生产和蚕种生产二种类型，蚕茧生产的主要目的是 获取优质、高产的茧丝，它与家蚕幼虫生长与代谢生理过程调控密切相关。 神经肽在昆虫的生长与物质能量代谢等重要生理过程调控中发挥重要作用。在 家蚕中存在有近40种神经肽，Corazonin是其中之一，其生理功能由Ventra于1989首 次鉴定，并由Hua等于2000年首次在家蚕中分离到。家蚕Corazonin的作用是通过家蚕 Corazonin受体（BmCrzR)来介导的，但有关BmCrzR介导Corazonin作用，来调控家蚕幼虫 生长与物质能量代谢等，均缺乏研究。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种提高家蚕幼虫体 重量的方法，是采用Rt-PCR克隆，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收，与哺乳动物表达载体 pFlag-CMV-3'连接，与T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合反应，再 给家蚕幼虫腹部注射的方法，通过调控家蚕物质能量代谢，提高家蚕幼虫体重量。 为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下： 1)解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链 cDNA； 2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)扩增，获得家蚕 Corazonin受体（BmCrzR)cDNA; 3)再以BmCrzR cDNA为模板，通过PCR扩增得到BmCrzR DNA片段，琼脂糖凝胶电 泳回收目的DNA片段，经Hindlll/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接， 获得pFLAG-BmCrzR ; 4)以pFLAG-BmCrzR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-BmCrzR DNA片段，琼脂糖凝 胶电泳回收得到纯化的大小为893bp的目的DNA片段，作为反应模板； 5)将反应模板与10 X T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合 进行反应，然后进行多次处理得到BmCrzR dsRNA ; 6)给四龄第2-3天的家蚕腹部注射10-20 μ g BmCrzR dsRNA，用桑叶继续饲养，获 得重量增加的五龄盛食期家蚕幼虫体。 所述步骤1)具体为：解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，使用Trizol试剂盒提 取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：65°C变 性 5min，42°C反应 60min，70°C灭活 15min，获得第 1 链cDNA。 所述步骤2)具体为：以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5 '-AAGCTTGCCACCAT GGACAACGAAGGCAACAGTAC-3'（如SEQIDNO. 1 的引物 1)和反向引物 5'-GGATCCCGTAACAAAC TAATGTTCTGTCCATTCG-3'（如SEQIDNO. 2的引物2)进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR) 扩增，克隆获得家香Corazonin受体（BmCrzR)cDNA。 所述的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)扩增条件是：94°C预变性30s，58°C退火 30s，72°C延伸2min，进行30个循环。 所述步骤3)得到BmCrzRDNA片段具体采用以下方式为：以BmCrzRcDNA为模板， 分别用正向引物 5' -AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3'（如SEQIDN0. 3 的引物 3)和 反向引物 5' -GGATCCTTATAACAAACTAATGTTCTGTCCAT-3'（如SEQIDN0. 4 的引物 4)进行 PCR扩增，其PCR扩增条件是：94°C预变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，30个循环，加 rTaq酶继续延伸15min，得到DNA片段。 所述步骤4)得到pFLAG-BmCrzRDNA片段具体采用以下方式为：以pFLAG-BmCrzR 为模板，分别用两个特异性引物Y-AAGCTTATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3 ^ (如SEQID Ν0· 5 的引物 5)和 5' -GGATCCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3'(如SEQIDΝ0· 6 的引 物6)进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94°C预变性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，30 个循环，得到DNA片段。 所述步骤5)具体为： 5. 1)在一试管内依次加入l-2yg反应模板、2yL10XT7反应缓冲液、2yLATP 液、2μLCTP液、2μLGTP液、2μLUTP溶液和2μLT7酶混合物； 5. 2)补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37°C反应16h，冷却至 常温； 5. 3)在上述混合液中加入1μLTURBODNA酶，混匀后，37°C下孵育15min，以消化 多余的反应模板； 5. 4)再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL7. 5M氯化锂和50mMEDTA，终止反 应； 5. 5)于4°C下15000rpm离心15min，除去上清液，加入lmL70%乙醇洗涤； 5. 6)于4°C下15000rpm离心15min，除去70%乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的 双蒸馏水溶解，得到BmCrzRdsRNA。 通过大量实验证实在不增加蚕食桑量的情况下，采用本专利技术方法后五龄盛食期家 蚕幼虫体重较对照区的增加约25 %。 本专利技术具有的有益效果是： 本专利技术提高家蚕幼虫体重量的方法，是没有增加蚕食桑量，通过调控家蚕代谢来 实现的，这对于研究家蚕的物质与能量代谢机制、进一步提高家蚕经济性状和生理机能以 及传统养蚕产业的技术革新等，具有积极作用。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例1 : 从五龄第3天的家蚕丝腺中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA:解剖并收集 五龄第3天的家蚕丝腺，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂 对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：65°C变性5min，42°C反应60min，70°C灭活15min， 获得第1链cDNA。 以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5'-AAGCTTGCCACCATGG ACAACGAAGGCAACAGTAC-3' 和反向引物 5'-GGATCCCGTAACAAACTAATGTTCTGTCCATTCG-3'，进 行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体（BmCrzR)cDNA。 RT-PCR扩增条件是：94°C预变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，进行30个循环。以BmCrzRcDNA为模板，分别用正向引物 5 '-AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGT AC-3' 和反向引物 5'本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高家蚕幼虫体重量的方法，其特征在于：1)解剖并收集五龄第3‑4天家蚕丝腺，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(RT‑PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA；3)再以BmCrzR cDNA为模板，通过PCR扩增得到BmCrzR DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag‑CMV‑3'连接，获得pFLAG‑BmCrzR；4)以pFLAG‑BmCrzR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG‑BmCrzR DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为893bp的目的DNA片段，作为反应模板；5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后进行多次处理得到BmCrzR dsRNA；6)给四龄第2‑3天的家蚕腹部注射10‑20μg BmCrzR dsRNA，用桑叶继续饲养，获得重量增加的五龄盛食期家蚕幼虫体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：时连根，杨静文，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33