用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞制造技术

本发明专利技术提供了用于调节用于免疫疗法的免疫效应细胞的特异性和活性的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明专利技术提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR被称为“NKR‑CAR”，其是包含自然杀伤(NK)细胞上天然存在的受体组分的CAR设计。在一个实施方案中，NK受体包括但不限于被称为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的NK细胞的天然存在的活化和抑制性受体。

Targeted cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy

The present invention provides a composition and method for regulating the specificity and activity of immune effector cells for immunotherapy. In one embodiment, the invention provides a chimeric antigen receptor (CAR), which CAR called \NKR CAR\, which contain natural killer (NK) cells are natural receptors on the components of the CAR design. In one embodiment, the NK receptor includes, but is not limited to, the natural activated and inhibitory receptors of NK cells, known as killer cell immunoglobulin like receptors (KIR).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞相关申请本申请要求2014年9月17日提交的PCT申请号PCT/CN2014/086694和2014年11月7日提交的PCT申请号PCT/CN2014/090578的优先权。这些申请各自的全部内容通过引用并入本文。专利技术背景使用基因转移技术，T细胞可以被遗传修饰以在其表面上稳定地表达抗体结合结构域，其赋予T细胞特异性，所述特异性独立于主要组织相容性复合体(MHC)所施加的约束。嵌合抗原受体(CAR)代表在T细胞(CART细胞)上表达的合成蛋白，其将抗体的抗原识别片段(例如scFv或单链可变区片段)与CD3-ζ链的胞内结构域融合。在与表达scFv的同源抗原的靶细胞相互作用时，在T细胞上表达的CAR可以触发导致靶细胞杀伤(也称为靶细胞裂解)的T细胞活化。当与额外的共刺激信号例如CD137或CD28的胞内结构域组合时，这些受体也能够产生增殖。然而，与正常T细胞受体(TCR)应答不同，这种增殖的一些似乎是抗原独立的(Miloneetal.,2009,MolTher17(8):1453-64)。人工受体不完全再现由天然TCR结合到与MHC分子复合的抗原肽所产生的细胞内信号转导(Brocker,2000,Blood96(5):1999-2001)。在不存在高水平的细胞因子如IL-2的情况下过继转移时，信号传导缺陷可以限制CART细胞的长期存活(Loetal.,2010,ClinCancerRes16(10):2769-80)。它们还具有改变的调节，其可能在一些抗癌应用中是有益的(Loskogetal.,2006,Leukemia20(10):1819-28)，但是这些调节缺陷也导致了控制它们对也表达抗原(甚至在极低水平)的正常组织的“脱靶”活性的潜在挑战。这些“脱靶”效应是对基于CAR的疗法的严重限制，并且已导致在CAR-修饰的T细胞的早期I期评估期间可能的死亡(Morganetal.,2010,MolTher18(4):843-51)。因此，本领域需要用于构建克服当前基于CAR的治疗剂的限制的CAR的替代方法。本专利技术解决了本领域中的这种未满足的需求。概述在第一方面，本专利技术的特征在于纯化的或非天然存在的自然杀伤细胞免疫功能受体-嵌合抗原受体(NKR-CAR)多肽，其包含一个，两个或全部细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域，例如NKR跨膜结构域和胞质结构域，例如NKR胞质结构域。在一个实施方案中，NKR-CAR多肽包含细胞外抗原结合结构域，以及以下的一个或两个:跨膜结构域，例如NKR跨膜结构域；或胞质结构域，例如NKR胞质结构域。在一个实施方案中，所述NKR-CAR多肽包含细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域和NKR胞质结构域。在一个实施方案中，NKR-CAR多肽包含胞外抗原结合结构域，NKR跨膜结构域和胞质结构域。在一个实施方案中，NKR-CAR多肽包含胞外抗原结合结构域，NKR跨膜结构域和胞质结构域。在一个实施方案中，所述NKR-CAR多肽包含KIR-CAR，例如actKIR-CAR或inhKIR-CAR，NCR-CAR，例如actNCR-CAR，SLAMF-CAR，例如inhSLAMF-CAR，FcR-CAR，例如，CD16-CAR，例如actCD16-CAR或CD64-CAR，例如actCD64-CAR，或Ly49-CAR，例如actLy49-CAR或inhLy49-CAR。在一个实施方案中，NKR-CAR多肽包含杀伤细胞免疫球蛋白样受体嵌合抗原受体(KIR-CAR)，其中KIR-CAR包含来自KIR的跨膜结构域(KIR跨膜结构域)或包含来自KIR的功能信号传导结构域的胞质结构域(KIR胞质结构域)的一个或两者。在一个实施方案中，KIR跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域:KIR2DS2,KIR2DL3,KIR2DL1,KIR2DL2,KIR2DL4,KIR2DL5A,KIR2DL5B,KIR2DS1,KIR2DS3,KIR2DS4,KIR2DS5,KIR3DL1,KIR3DS1,KIR3DL2,KIR3DL3,KIR2DP1和KIR3DP1。在一个实施方案中，KIR胞质结构域包含选自以下的蛋白质的功能信号传导结构域:KIR2DS2,KIR2DL3,KIR2DL1,KIR2DL2,KIR2DL4,KIR2DL5A,KIR2DL5B,KIR2DS1,KIR2DS3,KIR2DS4,KIR2DS5,KIR3DL1,KIR3DS1,KIR3DL2,KIR3DL3,KIR2DP1和KIR3DP1。在一个实施方案中，KIR-CAR进一步包含KIRD0结构域，KIRD1结构域和/或KIRD2结构域中的一个或多个。在一个实施方案中，所述NKRCAR多肽包含天然细胞毒性受体嵌合抗原受体(NCR-CAR)，其中所述NCR-CAR包含来自NCR的跨膜结构域(NCR跨膜结构域)或包含来自NCR的功能信号传导结构域的胞质结构域(NCR胞质结构域)中的一个或两个。在一个实施方案中，NCR跨膜结构域包含选自NKp46，NKp30和NKp44的蛋白质的跨膜结构域。在一个实施方案中，其中NCR胞质结构域包含选自NKp46，NKp30和NKp44的蛋白质的功能信号传导结构域。在一个实施方案中，NKRCAR多肽包含信号传导淋巴细胞活化分子家族嵌合抗原受体(SLAMF-CAR)，其中SLAMF-CAR包含来自SLAMF的跨膜结构域(SLAMF跨膜结构域)或包含来自SLAMF的功能信号传导结构域的胞质结构域(SLAMF胞质结构域)。在一个实施方案中，SLAMF跨膜结构域包含选自SLAM,CD48,CD229,2B4,CD84,NTB-A,CRACC,BLAME和CD2F-10的蛋白质的跨膜结构域。在一个实施方案中，SLAMF胞质结构域包含选自SLAM,CD48,CD229,2B4,CD84,NTB-A,CRACC,BLAME,和CD2F-10的蛋白质的功能信号传导结构域。在一个实施方案中，NKRCAR多肽包含Fc受体嵌合抗原受体(FcR-CAR)，其中FcR-CAR包含来自选自CD16或CD64的FcR的跨膜结构域或包含来自选自CD16或CD64的FcR的功能信号传导结构域的胞质结构域的一个或两者。在一个实施方案中，NKRCAR多肽包含Ly49受体嵌合抗原受体(Ly49-CAR)，其中Ly49-CAR包含来自Ly49的跨膜结构域(Ly49跨膜结构域)或包含来自Ly49的功能信号传导结构域的胞质结构域(Ly49胞质结构域)的一个或两者。在一个实施方案中，Ly49跨膜结构域包含选自Ly49A，Ly49C，Ly49H和Ly49D的蛋白质的跨膜结构域。在一个实施方案中，Ly49胞质结构域包含选自Ly49A，Ly49C，Ly49H和Ly49D的蛋白质的功能信号传导结构域。在一个实施方案中，NKR-CAR多肽的跨膜结构域是NKR跨膜结构域，其中NKR跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域:KIR2DS2，KIR2DL3，NKp46，KIR，NCR，SLAMF，FcR和Ly49。在一个实施方案中，跨膜结构域包含:i)SEQIDNO:357,358或359的氨基酸序列；ii)包含SEQIDNO:35本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码自然杀伤细胞免疫功能受体‑嵌合抗原受体(NKR‑CAR)的分离的核酸分子，其中编码的NKR‑CAR包含结合间皮素的细胞外非鼠抗原结合结构域，以及以下之一或两者:跨膜结构域，例如NKR跨膜结构域；或胞质结构域，例如NKR胞质结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.17 CN PCT/CN2014/086694;2014.11.07 CN PCT/1.编码自然杀伤细胞免疫功能受体-嵌合抗原受体(NKR-CAR)的分离的核酸分子，其中编码的NKR-CAR包含结合间皮素的细胞外非鼠抗原结合结构域，以及以下之一或两者:跨膜结构域，例如NKR跨膜结构域；或胞质结构域，例如NKR胞质结构域。2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述编码的NKR-CAR包含结合间皮素的细胞外非鼠抗原结合结构域，跨膜结构域和NKR胞质结构域。3.权利要求1或2的分离的核酸分子，其中结合间皮素的细胞外非鼠抗原结合结构域是结合间皮素的人或人源化抗原结合结构域。4.权利要求3的分离的核酸分子，其中所述结合间皮素的编码的人抗原结合结构域包含:表4中列出的任何人抗间皮素重链氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)，重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)；和/或表4中列出的任何人抗间皮素轻链氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCCDR1)，轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)。5.权利要求3或4的分离的核酸分子，其中所述结合间皮素的人抗原结合结构域包含:重链可变区，其包含:i)表4中列出的任何人抗间皮素重链可变区的氨基酸序列；ii)对表4中列出的任何人抗间皮素重链可变区的氨基酸序列具有至少一个，两个或三个修饰但不多于30,20或10个修饰的氨基酸序列；或iii)与表4中列出的任何人抗间皮素重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其包含:i)表4中列出的任何人抗间皮素轻链可变区的氨基酸序列；ii)对表4中所列的任何人抗间皮素轻链可变区的氨基酸序列具有至少一个，两个或三个修饰但不超过30,20或10个修饰的氨基酸序列；或iii)与表4中所列的任何人抗间皮素轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。6.权利要求3-5中任一项的分离的核酸分子，其中结合间皮素的人抗原结合结构域包含:i)SEQIDNOs:234,240,230-233,235-239,和241-253中任一个的氨基酸序列；ii)对SEQIDNOs:234,240,230-233,235-239,和241-253中的任何一个具有至少一个，两个或三个修饰但不超过30,20或10个修饰的氨基酸序列；或者iii)与SEQIDNOs:234,240,230-233,235-239,和241-253中任一个具有95-99％同一性的氨基酸序列。7.前述权利要求中任一项的分离的核酸分子，其中编码的NKR-CAR包含:杀伤细胞免疫球蛋白样受体嵌合抗原受体(KIR-CAR)，其中所述KIR-CAR包含来自KIR的跨膜结构域(KIR跨膜结构域)或包含来自KIR的功能信号传导结构域的胞质结构域(KIR胞质结构域)之一或两者；天然细胞毒性受体嵌合抗原受体(NCR-CAR)，其中所述NCR-CAR包含来自NCR的跨膜结构域(NCR跨膜结构域)或包含来自NCR的功能信号传导结构域的胞质结构域(NCR胞质结构域)之一或两者；信号传导淋巴细胞活化分子家族嵌合抗原受体(SLAMF-CAR)，其中所述SLAMF-CAR包含来自SLAMF的跨膜结构域(SLAMF跨膜结构域)或包含来自SLAMF的功能信号传导结构域的胞质结构域(SLAMF胞质结构域)之一或两者；Fc受体嵌合抗原受体(FcR-CAR)，其中所述FcR-CAR包含来自选自CD16或CD64的FcR的跨膜结构域或包含来自选自CD16或CD64的FcR的功能信号传导结构域的胞质结构域之一或两者；或Ly49受体嵌合抗原受体(Ly49-CAR)，其中所述Ly49-CAR包含来自Ly49的跨膜结构域(Ly49跨膜结构域)或包含来自Ly49的功能信号传导结构域的胞质结构域(Ly49胞质结构域)之一或两者。8.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述KIR跨膜结构域包含选自以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：KIR2DS2,KIR2DL3,KIR2DL1,KIR2DL2,KIR2DL4,KIR2DL5A,KIR2DL5B,KIR2DS1,KIR2DS3,KIR2DS4,KIR2DS5,KIR3DL1,KIR3DS1,KIR3DL2,KIR3DL3,KIR2DP1和KIR3DP1。9.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述KIR胞质结构域包含选自以下组成的组的蛋白质的功能信号传导结构域:KIR2DS2,KIR2DL3,KIR2DL1,KIR2DL2,KIR2DL4,KIR2DL5A,KIR2DL5B,KIR2DS1,KIR2DS3,KIR2DS4,KIR2DS5,KIR3DL1,KIR3DS1,KIR3DL2,KIR3DL3,KIR2DP1和KIR3DP1。10.权利要求7-9中任一项的分离的核酸分子，其中所述KIR-CAR还包含KIRD0结构域，KIRD1结构域和/或KIRD2结构域中的一个或多个。11.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述NCR跨膜结构域包含选自以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域:NKp46，NKp30和NKp44。12.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述NCR胞质结构域包含选自以下组成的组的蛋白质的功能信号传导结构域:NKp46，NKp30和NKp44。13.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述SLAMF跨膜结构域包含选自以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域:SLAM,CD48,CD229,2B4,CD84,NTB-A,CRACC,BLAME,和CD2F-10。14.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述SLAMF胞质结构域包含选自以下组成的组的蛋白质的功能信号传导结构域:SLAM,CD48,CD229,2B4,CD84,NTB-A,CRACC,BLAME,和CD2F-10。15.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述Ly49跨膜结构域包含选自以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域:Ly49A,Ly49C,Ly49H,和Ly49D。16.权利要求7的分离的核酸分子，其中所述Ly49胞质结构域包含选自Ly49A,Ly49C,Ly49H,和Ly49D的蛋白质的功能信号传导结构域。17.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码的跨膜结构域包含NKR跨膜结构域，所述NKR跨膜结构域包含选自以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域:KIR2DS2,KIR2DL3,NKp46,杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，天然细胞毒性受体(NCR)，信号传导淋巴细胞活化分子家族(SLAMF)，Fc受体(FcR)和Ly49受体(Ly49)。18.权利要求17的分离的核酸分子，其中i)编码的跨膜结构域包含SEQIDNO:357,358或359的氨基酸序列；包含SEQIDNO:357,358或359的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰但不多于5个修饰的氨基酸序列；或与SEQIDNO:357,358或359具有95-99％序列同一性的氨基酸序列；或ii)编码跨膜结构域的核酸序列包含SEQIDNO:343的核苷酸771-830，SEQIDNO:345的核苷酸773-832，或SEQIDNO:347的核苷酸803-875，或其具有95-99％的序列同一性的核酸序列。19.权利要求1-6和17-18中任一项的分离的核酸分子，其中所述编码的胞质结构域包含NKR胞质结构域，所述NKR胞质结构域包含选自KIR2DS2，KIR2DL3，NKp46，DAP12，KIR，NCR，SLAMF，FcR和Ly49的蛋白质的一个或多个功能信号传导结构域。20.权利要求19的分离的核酸分子，其中i)编码的胞质结构域包含SEQIDNO:360,361或362的氨基酸序列；包含SEQIDNO:360,361或362的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰但不超过20,10或5个修饰的氨基酸序列；或与SEQIDNO:360,361或362具有95-99％序列同一性的氨基酸序列；或者ii)编码胞质结构域的核酸序列包含SEQIDNO:343的核苷酸831-947，SEQIDNO:345的核苷酸833-1060或SEQIDNO:347的核苷酸876-949，或其具有95-99％的序列同一性的核酸序列。21.前述权利要求中任一项的分离的核酸分子，还包含编码SEQIDNO:1的氨基酸序列的前导序列。22.前述权利要求中任一项的分离的核酸分子，其中结合间皮素的细胞外非鼠抗原结合结构域通过铰链结构域连接到跨膜结构域。23.权利要求22的分离的核酸分子，其中编码的铰链结构域选自CD8铰链，GS铰链，IgG4铰链，IgD铰链，KIR2DS2铰链，KIR铰链，NCR铰链，SLAMF铰链，FcR铰链和LY49铰链。24.权利要求23的分离的核酸分子，其中:i)编码的铰链结构域包含SEQIDNO:5,2,3或4的氨基酸序列；包含SEQIDNO:5,2,3或4的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰但不多于5个修饰的氨基酸序列；或者与SEQIDNO:5,2,3或4的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列；或ii)编码铰链结构域的核酸序列包含SEQIDNO:356,16,13,14或15的核酸序列或其具有95-99％同一性的核酸序列。25.权利要求6的分离的核酸分子，其中:i)编码的跨膜结构域和胞质结构域共同包含:SEQIDNO:333的氨基酸413-487或SEQIDNO:335的氨基酸386-454的氨基酸序列；对SEQIDNO:333的氨基酸413-487或SEQIDNO:335的氨基酸386-454具有至少一个，两个或三个修饰但不多于30,20或10个修饰的氨基酸序列；或者与SEQIDNO:333的氨基酸413-487或SEQIDNO:335的氨基酸386-454具有95-99％同一性的氨基酸序列；或ii)编码跨膜结构域和胞质结构域的核酸序列包含SEQIDNO:332的核苷酸1237-1464或SEQIDNO:334的核苷酸1156-1365，或其具有95-99％同一性的序列。26.根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸分子，还包含编码衔接分子的核酸序列。27.权利要求26的分离的核酸分子，其中编码的衔接分子包含DAP12或Fcε受体γ(FcεRγ)的功能信号传导结构域。28.根据权利要求26或27所述的分离的核酸分子，其中:i)编码的衔接分子包含SEQIDNO:333的氨基酸1-113或SEQIDNO:335的氨基酸1-86的氨基酸序列；对SEQIDNO:333的氨基酸1-113或SEQIDNO:335的氨基酸1-86具有至少一个，两个或三个修饰但不多于20,10或5个修饰的氨基酸序列；或与SEQIDNO:333的氨基酸1-113或SEQIDNO:335的氨基酸1-86具有95-99％同一性的氨基酸序列；或ii)编码衔接分子的核酸序列包含SEQIDNO:332的核苷酸1-339或SEQIDNO:334的核苷酸1-258。29.根据权利要求26-28中任一项所述的分离的核酸分子，还包含编码选自T2A，P2A，E2A和F2A的肽切割位点的核酸序列，并且其中编码所述肽切割位点的核酸将编码NKR-CAR的核酸序列连接到编码衔接分子的核酸序列。30.权利要求29的分离的核酸分子，其中编码肽切割位点的核酸序列编码SEQIDNO:57,58,59或60的氨基酸序列；或与其具有95-99％序列同一性的氨基酸序列。31.根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸分子，还包含编码TCAR或第二NKR-CAR的核酸序列。32.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·比蒂，B·恩格斯，N·伊达马坎提，C·H·琼，A·洛，M·C·米伦，宋慧娟，E·王，吴期隆，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，宾夕法尼亚大学托管会，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH