抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO‑S中的表达、纯化方法技术

本发明专利技术公开了抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO‑S中的表达、纯化方法。Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，包含如下步骤：(1)体外化学合成Lunasin基因；(2)PCR扩增Lunasin基因；(3)真核细胞表达载体的改造；(4)将Lunasin基因连接到改造后的哺乳动物细胞表达载体pZWCT1上；(5)阳性克隆的鉴定；(6)表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO‑S；(7)高密度细胞培养生产Lunasin多肽；(8)Lunasin多肽的分离纯化。本发明专利技术使Lunasin多肽的规模化生产成为可能，成本低、产量高，蛋白修饰准确，而且蛋白纯化方便简单。

【技术实现步骤摘要】
抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO-S中的表达、纯化方法
本专利技术属于蛋白质工程领域，涉及抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO-S中的表达、纯化方法。
技术介绍
Lunasin多肽是一种最早分离于大豆的富含天冬氨酸(Asp)的活性肽(分子量为5.5KD)，由43个氨基酸组成，序列为SKWQHQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD。N端第1-22个氨基酸序列的功能目前尚不清楚，第23-31个氨基酸序列可使Lunasin定位到染色体组蛋白H3和H4上，第32-34氨基酸Arg-Gly-Asp(RGD)是一个细胞黏附基序，可使Lunasin进入细胞核。它的C端连续9个Asp可使Lunasin多肽结合到染色体着丝粒处，使微管不能粘附在着丝粒着丝点上(Hernández-Ledesmaetal.2009)。Lunasin多肽的上述性质使其具有显著的抗癌活性。目前研究表明，Lunasin多肽的抗癌机理主要有：Lunasin多肽通过与肿瘤细胞内乙酰化的核心组蛋白特异性结合，抑制核心组蛋白去乙酰化，从而阻断细胞的有丝分裂，最终导致肿瘤细胞的死亡(Hernández-Ledesmaeta1.2011)；在肿瘤细胞模型的实验中，Lunasin多肽的抗癌作用不依赖于抑制组蛋白的去乙酰化，而是通过干扰肿瘤细胞的信号通路从而抑制肿瘤细胞的生长(Dia&Mejia,2011；Kapoor,2014)。此外，Lunasin多肽还可以和免疫细胞因子--白细胞介素(IL-12或者IL-2)协同作用，提高杀伤肿瘤细胞的作用(Changetal.2014)。大量的研究表明，炎症反应是诱发肿瘤发生、形成和发展的一个重要因素。而Lunasin多肽在抗细胞炎症反应中也可以发挥重要的功能。如：Lunasin多肽可以抑制脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞RAW264.7后促炎因子前列腺素2(PGE2)和一氧化氮(NO)的形成，通过抑制NF-κB通路来发挥抗炎症的作用(Diaetal.2009；Mejia&Dia,2009)。最近，Jia等研究发现Lunasin多肽可以通过诱导细胞凋亡抑制类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的增殖，进一步通过抑制细胞内促炎细胞因子(IL-6，IL-8和基质金属蛋白酶)的产生，而发挥抗炎症作用(Jiaetal.2015)。Lunasin多肽可抗肠道和血清降解，在抵达靶器官和血液后仍保持活性和完整性。因此，Lunasin多肽在抗癌抗炎症方面具有极大的应用潜力，将在人类健康中发挥重大作用。目前，Lunasin多肽主要有从天然物质中分离、化学合成、谷类发酵、重组表达的方法。但是从天然物质中分离步骤繁琐、劳动强度大，化学合成则成本昂贵，无法满足后续体内外实验的研究需要。重组的途径则成为大量生产Lunasin多肽的首选方法之一。但目前公开的重组制备Lunasin多肽的方法仅限于大肠杆菌原核表达以及毕赤酵母真核表达。相比于大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统发展较晚，而且细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上也影响了它的广泛应用。因此，目前尚未见在哺乳动物细胞中重组表达Lunasin多肽的相关报道。大肠杆菌原核表达系统具有操作简单、表达水平高、周期短、易于大规模高密度培养、成本低等优点，往往成为表达抗体片段以及表达产物翻译后修饰的有无不影响功能和活性的蛋白类药物的首选表达系统。而对于Lunasin多肽来说，表达产物多肽链的折叠、二硫键的形成等常影响表达产物的合成分泌、生物活性、体内稳定性及免疫原性等特性。由于原核细胞缺少内质网和高尔基体等可用于进行糖基化的结构和机制，所表达的产物是非糖基化的，且常常以包涵体的形式存在；酵母、昆虫及植物等真核细胞虽能进行糖基化，但其糖基化的方式与人类等哺乳动物细胞糖基化的方式是不一样的。与其他真核细胞表达系统相比，在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，并且哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L以上。因此，建立哺乳动物细胞高效表达体系及高表达工程细胞株的获得，是制药基因工程药物研究和生产的瓶颈，也是研究方向。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种利用哺乳动物细胞CHO-S高水平、高质量表达抗癌、抗炎多肽Lunasin的方法。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，包含如下步骤：(1)体外化学合成Lunasin基因；(2)以体外化学合成的Lunasin基因为模板，设计含有特异性酶切位点的引物，PCR扩增Lunasin基因；(3)真核细胞表达载体的改造：以哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1为骨架，在多克隆位点中分别加入引导表达蛋白质分泌的小鼠的IL2信号肽基因序列，用于纯化目的蛋白质的6个连续的编码组氨酸的基因序列，以及用以增加蛋白质表达量的强启动子WPRE，将改造后的表达载体命名为pZWCT1；(4)通过双酶切和T4DNA连接酶方法将Lunasin基因连接到改造后的哺乳动物细胞表达载体pZWCT1上；(5)阳性克隆的鉴定；(6)表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO-S；(7)高密度细胞培养生产Lunasin多肽；(8)Lunasin多肽的分离纯化。其中，步骤(2)中所述的含有特异性酶切位点的引物优选含有EcoRI和XhoI酶切位点的引物，上游引物序列如SEQIDNO.2所示，下游引物序列如SEQIDNO.3所示.所述的步骤(3)真核细胞表达载体的改造的具体方法优选包括以下步骤：以pCDNA3.1载体为骨架，用内切酶NheI和EcoRI双酶切，然后连接合成的编码小鼠IL2信号肽和6个连续组氨酸的基因序列(两端含NheI和EcoRI酶切位点)，连接成功之后，再用内切酶XhoI和ApaI双酶切，用同样的技术手段将强启动子WPRE连接入多克隆位点，载体改造成功。步骤(5)所述的阳性克隆的鉴定方法优选为菌落PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序鉴定中的一种或多种。步骤(6)所述的表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO-S的方法为：将CHO-S细胞密度调为2.5×106/ml后转染表达载体。运用很少分泌自身内源蛋白、转录翻译后修饰准确且能以悬浮培养方式达到高密度培养的CHO-S细胞株合成Lunasin多肽，转染表达载体的CHO-S细胞在培养的过程中能持续高密度生长并持续合成和分泌Lunasin多肽，转染改造后的表达载体的CHO-S细胞在培养过程中细胞密度能超过1.5×107/ml，远高于普通细胞培养5×105/ml的密度。步骤(7)所述的高密度细胞培养生产Lunasin多肽的方法优选为：在GibcoBRL公司的无血清IMDM培养基(IMDM粉17.7g/L，NaHCO33.04g/L，过滤除菌)中培养CHO-S细胞，培养条件为在5％CO2浓度孵箱，37℃，100-150rpm振荡培养10天，CHO-S细胞能在无血清的培养基中持续高密度生长。步骤(8)所述的Lunasin多肽的分离纯化方法优选为：离心后收取上清液，运用镍离子柱亲和纯化Lunasin蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，其特征在于包含如下步骤：(1)体外化学合成Lunasin基因；(2)以体外化学合成的Lunasin基因为模板，设计含有特异性酶切位点的引物，PCR扩增Lunasin基因；(3)真核细胞表达载体的改造：以哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1为骨架，在多克隆位点中分别加入引导表达蛋白质分泌的小鼠的IL2信号肽基因序列，用于纯化目的蛋白质的6个连续的编码组氨酸的基因序列，以及用以增加蛋白质表达量的强启动子WPRE基因序列，将改造后的表达载体命名为pZWCT1；(4)通过双酶切和T4 DNA连接酶方法将Lunasin基因连接到改造后的哺乳动物细胞表达载体pZWCT1上；(5)阳性克隆的鉴定；(6)表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO‑S；(7)高密度培养生产Lunasin多肽；(8)Lunasin多肽的分离纯化。

【技术特征摘要】
1.Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，其特征在于包含如下步骤：(1)体外化学合成Lunasin基因；(2)以体外化学合成的Lunasin基因为模板，设计含有特异性酶切位点的引物，PCR扩增Lunasin基因；(3)真核细胞表达载体的改造：以哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1为骨架，在多克隆位点中分别加入引导表达蛋白质分泌的小鼠的IL2信号肽基因序列，用于纯化目的蛋白质的6个连续的编码组氨酸的基因序列，以及用以增加蛋白质表达量的强启动子WPRE基因序列，将改造后的表达载体命名为pZWCT1；(4)通过双酶切和T4DNA连接酶方法将Lunasin基因连接到改造后的哺乳动物细胞表达载体pZWCT1上；(5)阳性克隆的鉴定；(6)表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO-S；(7)高密度培养生产Lunasin多肽；(8)Lunasin多肽的分离纯化。2.根据权利要求1所述的Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，其特征在于步骤(2)中所述的含有特异性酶切位点的引物为含有EcoRI和XhoI酶切位点的引物，上游引物序列如SEQIDNO.2所示，下游引物序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1所述的Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，其特征在于所述的步骤(3)真核细胞表达载体的改造的具体方法包括以下步骤：首先运用内切酶NheI和EcoRI同时双酶切表达载体pcDNA3.1及体外合成的如SEQIDNO....

【专利技术属性】
技术研发人员：薛佳宇，周广灿，王元涛，张艳梅，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，王元涛，
类型：发明
国别省市：江苏,32