核酸构建体制造技术

本发明专利技术提供核酸构建体，其包含以下结构：A‑X‑B，其中A是编码包含第一信号肽的第一多肽的核酸序列；B是编码包含第二信号肽的第二多肽的核酸序列，并且X是编码切割位点的核酸序列，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽包含一个或多个突变，使得其具有较少的疏水性氨基酸。

Nucleic acid construction

The present invention provides nucleic acid constructs, which comprises the following structure: A X B, where A is the first nucleic acid sequence encoding a polypeptide comprising a first signal peptide; B is a nucleic acid sequence encoding a polypeptide containing second second signal peptide, and X is a nucleic acid sequence encoding cleavage site, wherein the first signal peptide or the second signal peptide contains one or more mutations, which has less hydrophobic amino acids.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸构建体专利
本专利技术涉及用于调节从单个载体共表达的多肽的相对表达的构建体和方法。特别地，本专利技术涉及调节从单个载体与第二多肽共表达的跨膜蛋白的表达。专利技术背景通常希望从同一载体表达不同的蛋白质，因为同一细胞的多重转导是困难的，昂贵的和不可预测的。因此已经开发了不同的方法以允许从单个载体共表达两种蛋白(参见图1)。最初的尝试在同一盒中使用两种不同的启动子。这产生两个单独的转录物，其每个编码单独的蛋白质。因为一些原因，这是困难的方法。一个关键问题是“启动子干扰”，其中一个启动子占据优势并引起第二个启动子的沉默。此外，不同的启动子在不同的细胞环境中差异起作用，这使得难以实现每个转基因的相对表达的一致的“调整(tuning)”。另一种方法是使用内部核糖体进入序列(IRES)。这里，生成单个转录物。该转录物中的IRES序列置于两个转基因的开放阅读框之间，并模拟mRNA帽结构。因此，核糖体在5’帽或者IRES起始翻译，导致两个单独的蛋白的表达。这种方法的关键限制是不能控制相对表达。3'转录物通常表达得少于5'转录物，但表达比例难以预测和调整。在口蹄疫病毒(FMDV)2A肽在允许FMDV(和相关病毒)从单个开放阅读框(ORF)表达多个蛋白质中的作用表征之后，提供了进一步的方法(Donnellyetal；J.Gen.Virol.；82,1027–1041(2001))。在ORF的翻译后，2A肽(和同源物)立即以非常高的效率切割，使得能够从单个ORF表达多个肽。使用2A肽在同一ORF中的不同肽之间切割的问题是表达被限制为1:1的比例。因此，需要与上述缺点不相关的用于从单个载体表达多于一个蛋白质的替代方法。专利技术概述本专利技术基于确定当两个含有信号肽的蛋白作为在翻译后切割的多聚蛋白共表达时，可以改变信号肽的相对“强度”，从而控制两个蛋白质的相对表达。这不需要限于转基因对，而可用于允许控制最初翻译为多聚蛋白的多个蛋白的相对表达。如本文所用，“多聚蛋白”是指下述的多肽序列，其从单个核酸构建体翻译成单个实体，但包含随后分离并且作为离散实体(例如分离的蛋白质)发挥功能的多肽序列。因此，本专利技术的第一个方面提供核酸构建体，其包括以下结构：A-X-B其中A是编码包含第一信号肽的第一多肽的核酸序列；B是编码包含第二信号肽的第二多肽的核酸序列，并且X是编码切割位点的核酸序列，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽包含一个或多个突变，使得其具有较少的疏水性氨基酸。突变的信号肽可以比其衍生自的“野生型”信号肽具有更少的疏水性氨基酸。突变的信号肽可以比另一多肽的信号肽具有更少的疏水性氨基酸。疏水性氨基酸可以选自下组：丙氨酸(A)；缬氨酸(V)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；甲硫氨酸(M)；苯丙氨酸(P)；酪氨酸(Y)；色氨酸(W)。第一信号肽和第二信号肽可衍生于相同的序列，但是与另一个信号肽相比，一个信号肽包含一个或多个氨基酸缺失或取代以去除或替换一个或多个疏水性氨基酸。如下文更详细解释的，信号序列具有三分型(tripartite)结构，由疏水性核心区(h-区)和侧翼的n-和c-区组成。第一信号肽和第二信号肽可以具有相同的n-和c-区，但在h-区中可以不同：一个信号肽的h-区比另一信号肽的h-区具有更多的疏水性氨基酸。从信号肽缺失或替换的疏水性氨基酸可以是选自下组：丙氨酸(A)；缬氨酸(V)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；甲硫氨酸(M)；苯丙氨酸(P)；酪氨酸(Y)；色氨酸(W)。从信号肽缺失或替换的疏水性氨基酸可以是选自下组：缬氨酸(V)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；和色氨酸(W)。一个多肽的信号肽可以比另一个信号肽多包含直至5个疏水性氨基酸。可以对改变的信号肽替换或去除直至(upto)10％，直至20％，直至30％，直至40％或直至50％的其疏水性氨基酸。第一和第二多肽可以是含有信号肽的多肽，例如分泌蛋白，跨膜蛋白或细胞器蛋白。本专利技术使得能够控制蛋白的相对表达，即在相关区室中蛋白的相对量。对于分泌蛋白，本专利技术使得能够控制由细胞产生的蛋白的相对量。对于跨膜蛋白，本专利技术使得能够控制两个(或更多个)蛋白的相对细胞表面表达。对于细胞器蛋白，本专利技术使得能够控制讨论中的细胞器之中或膜上的蛋白的相对表达。第一和第二多肽可以都是跨膜蛋白，例如T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。在第一和第二蛋白是跨膜蛋白的情况下，第一和第二信号肽之间的差异可以使得当核酸构建体在细胞中表达时，在细胞表面存在第一和第二多肽的差异相对表达。X可以是编码自切割肽，弗林蛋白酶切割位点或烟草蚀刻病毒切割位点的核酸序列。X可以是编码来自口蹄病毒或心脏病毒的2A自切割肽或2A样肽。在第二个方面，本专利技术提供载体，其包含根据前述权利要求任一项的核酸构建体。载体可以是例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。在第三个方面，提供细胞，其包含根据本专利技术的第一个方面的核酸构建体或根据本专利技术的第二个方面的载体。在这第三个方面，还提供细胞，其包含具有不同信号肽的两种嵌合抗原受体。该两个信号肽可以具有不同数量的疏水性氨基酸。在这一方面，具有含有较多数量的疏水性氨基酸的信号肽的嵌合抗原受体比具有含有较少数量的疏水性氨基酸的信号肽的嵌合抗原受体可以更高地在细胞表面表达。还提供细胞，其包含具有不同信号肽的两种嵌合抗原受体，其中一种嵌合抗原受体的信号肽包含一个或多个突变，使得其具有较少的疏水性氨基酸。具有突变的信号肽的嵌合抗原受体比具有未突变的信号肽的嵌合抗原受体以更低水平在细胞表面表达。细胞可以是细胞溶解性免疫细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在第四个方面，提供用于制备根据本专利技术的第四个方面的细胞的方法，其包括将根据本专利技术的第一个方面的核酸构建体或根据本专利技术的第二个方面的载体引入细胞中的步骤。在第五个方面，提供用于调节从单个核酸构建体与含有信号肽的第二蛋白一起表达的含有信号肽的第一蛋白的相对细胞表面表达的方法，其包括突变编码一个蛋白的信号肽的核酸序列的步骤，以便与另一个蛋白的信号肽相比去除或替换一个或多个疏水性氨基酸。与具有未修饰的信号肽的跨膜蛋白相比，从跨膜蛋白的信号肽去除或替换疏水性氨基酸减少在细胞表面上表达的跨膜蛋白的量。因此，可以调节衍生自包括第二多肽的多聚蛋白的跨膜蛋白的相对表达水平。当跨膜蛋白仅在细胞表面具有活性(或主要在细胞表面上具有活性)时，降低蛋白的相对细胞表面表达也降低其相对活性。可以延伸本专利技术以调节由切割位点分开的作为联接(concatenated)多肽表达的三种或更多种蛋白质的相对表达，并且通过不同活性的信号肽决定相对表面表达。附图简述图1：用于从同一载体表达不同蛋白的方法(a)同一盒内的两个不同的启动子导致两个不同的转录物，其各自产生单独的蛋白。(b)使用内部核糖体进入序列(IRES)导致单个转录物，所述单个转录物翻译成两个单独的蛋白。(c)FMDV2A肽的使用导致单个转录物和单个多聚蛋白，其快速切割成两个单独的蛋白。图2：说明信号序列在蛋白质靶向中的功能的示意图图3：编码两种CAR的核酸构建体示意图图4：验证取代的信号序列的功能。PCT/GB2014/053452描述了编码两种嵌合抗原受体(CAR)(一种针对CD19，一种针对CD33)的载体系统。在该研究中用于CAR的信号肽是来自本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸构建体，其包含以下结构：A‑X‑B其中A是编码包含第一信号肽的第一多肽的核酸序列；B是编码包含第二信号肽的第二多肽的核酸序列，并且X是编码切割位点的核酸序列，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽包含一个或多个突变，使得其具有较少的疏水性氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.27 GB 1507108.71.核酸构建体，其包含以下结构：A-X-B其中A是编码包含第一信号肽的第一多肽的核酸序列；B是编码包含第二信号肽的第二多肽的核酸序列，并且X是编码切割位点的核酸序列，其中所述第一信号肽或所述第二信号肽包含一个或多个突变，使得其具有较少的疏水性氨基酸。2.根据权利要求1的核酸构建体，其中所述第一信号肽和所述第二信号肽可衍生于相同的序列，但是一个信号肽与另一个信号肽相比包含一个或多个氨基酸缺失/取代以去除/替换一个或多个疏水性氨基酸。3.根据权利要求2的核酸构建体，其中所述疏水性氨基酸选自下组：丙氨酸(A)；缬氨酸(V)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；甲硫氨酸(M)；苯丙氨酸(P)；酪氨酸(Y)；色氨酸(W)。4.根据权利要求3的核酸构建体，其中所述疏水性氨基酸选自下组：缬氨酸(V)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；和色氨酸(W)。5.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中一个信号肽比另一个信号肽多包含直至5个疏水性氨基酸。6.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述第一和第二多肽二者都是跨膜蛋白。7.根据权利要求6的核酸构建体，其中所述第一和第二跨膜蛋白二者都是嵌合抗原受体(CAR)。8.根据权利要求6或7的核酸构建体，其中所述第一和所述第二信号肽之间的差异是使得当所述核酸构建体在细胞中表达时，在所述细胞表面存在所述第一和第二多肽的差异相对表达。9.根据前述权利要求中...

【专利技术属性】
技术研发人员：M普莱，S科多巴，
申请(专利权)人：UCL商务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB