【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本披露涉及新颖的转录因子，这些新颖的转录因子通过与靶向目的基因的dna结合结构域融合来调节该目的基因的表达。
技术介绍
1、导致一种或多种基因或基因产物的转录或活性降低的基因组改变是多种哺乳动物疾病的致病因子。一种这样的基因组改变是单倍剂量不足(haploinsufficiency)。在单倍剂量不足的情况下，仅存在基因的一个功能性拷贝，并且该单个拷贝不能产生足够的基因产物来产生野生型表型。另一种类型的疾病是由基因的一个或两个拷贝中的基因组变化引起的，这改变了基因产物，使得基因产物展现出降低的活性而非活性的消除。在又一种类型的疾病中，基因组改变减少了基因的一个或两个拷贝的转录或降低了转录物的稳定性，使得产生野生型表型的基因产物丰度将不足。
2、已经尝试了许多方法通过增加转录或活性降低的一种或多种基因的量或活性来治疗这样的疾病。这样的方法之一是通过腺相关病毒(aav)载体将靶基因的野生型拷贝递送给患者以产生功能性蛋白质。腺相关病毒(aav)是可感染人和一些其他灵长类动物物种的小的、复制缺陷型、无包膜病毒。aav的几个特征使得该病毒成为通过基因疗法递送治疗性蛋白质的有吸引力的媒介物(vehicle)，包括例如，已知aav不会引起人疾病并诱导温和的免疫反应，并且aav载体可以感染分裂细胞和休眠细胞而无需整合到宿主细胞基因组中。然而，aav基因疗法载体确实具有一些缺点。特别是，aav载体的克隆能力由于病毒dna的包装能力而受到限制。野生型aav的单链dna基因组为大约4.7千碱基(kb)。实际上，高达约5.0kb的aav基因组
3、由于这种大小限制，大的治疗性基因(例如，长度大于约4.4kb的那些)通常不适合用于aav载体中。克服aav大小限制的一种方法是递送靶向靶基因的启动子区域的转录因子，而不是递送靶基因本身，从而增加基因的靶基因转录。因此，需要改进的转录因子、特别是尺寸小且活性强的转录因子，这些转录因子适合通过aav载体递送并且可以调节任何内源性基因的表达以帮助逆转疾病或障碍的影响，尤其需要具有降低的免疫原性、降低的脱靶效应、增加的对靶基因的特异性和/或增加的治疗性功效的疗法。
技术实现思路
1、在一个方面，本文提供了包含dna结合结构域和至少三个转录活化结构域(tad)的转录因子，其中这些tad可以相同或不同。
2、在一些实施例中，tad包含i)至少一个酸性tad和至少一个富含q的tad，或ii)至少一个酸性tad和至少一个富含p的tad。在一些实施例中，其中酸性tad包含选自vp16、vp64、vp7、atf6、tfe3、atf6-11、或其片段的tad的一个或多个拷贝。在一些实施例中，富含q的tad包含选自oct2-q、sp1-q1、或其片段的tad的一个或多个拷贝。在一些实施例中，富含p的tad包含选自tfap2-p、oct2-p、或其片段的tad的一个或多个拷贝。
3、在一些实施例中，tad选自由以下组成的组：全长vp64、vp16的一个或多个重复、全长或部分p65、全长rta、全长vp7、全长或部分tef3、全长或部分atf6-11、全长或部分酸性atf6、全长或部分富含q的sp1、全长或部分富含q的oct2、全长或部分富含p的oct2、全长或部分富含p的tfap2、vp64的活性片段、p65的转录活性片段、rta的转录活性片段、vp7的活性片段、tef3的活性片段、atf6-11的活性片段、酸性atf6的活性片段、富含q的sp1的活性片段、富含q的oct2的活性片段、富含p的oct2的活性片段、富含p的tfap2的活性片段、及其任何组合。
4、在一些实施例中，tad的总长度在长度上小于2000aa、小于1500aa、小于1000aa、小于750aa、小于500aa、小于300aa、小于250aa、小于200aa或小于150aa。
5、在一些实施例中，转录因子包含seq id no:1-28的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在某些实施例中，转录因子包含具有seq id no:1-18中任一个的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
6、在一些实施例中，编码转录因子的核酸序列包含seq id no:30-47的序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列。
7、在一些实施例中，dna结合结构域在有或没有接头的情况下与转录因子中任一个的转录因子连接。在某些实施例中，dna结合结构域直接或通过接头与转录因子的n末端连接。在某些实施例中，dna结合结构域直接或通过接头与转录因子的c末端连接。在某些实施例中，接头包含ggsgggsg(seq id no:59)或ggsgggsgggsgggsg(seq id no:60)或由其组成。
8、在一些实施例中，dna结合结构域与目的基因的基因组区域结合。在某些实施例中，dna结合结构域是grna/cas复合物、转录活化因子样(tal)效应子或锌指蛋白。在某些实施例中，grna/cas复合物中的cas分子是或衍生自酿脓链球菌(s.pyogenes)cas9、空肠弯曲菌(c.jejune)cas9、金黄色葡萄球菌(s.aureus)cas9或δ-变形菌(dpb)casx。
9、在一些实施例中，cas分子缺乏一种或多种活性，任选地其中一种或多种活性是切割活性。
10、在一些实施例中，cas分子由包含少于4,000个核苷酸的核酸分子编码，任选地其中cas分子由包含少于3,500个核苷酸或少于2,500个核苷酸的核酸分子编码。在某些实施例中，cas分子是或衍生自金黄色葡萄球菌cas9。
11、在一些实施例中，与野生型cas分子序列相比，cas分子包含一个或多个氨基酸的缺失。
12、在一些实施例中，dna结合结构域是锌指蛋白。在一些实施例中，锌指蛋白包含六个至九个锌指结构域。在一些实施例中，锌指蛋白与目的基因的启动子区域结合。在某些实施例中，锌指蛋白与目的基因的启动子区域的6、9、12、15、18、21、24或27bp序列结合。
13、在一些实施例中，锌指蛋白包含与seq id no:61、seq id no:70、seq id no:71、或seq id no:73具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。
14、在另一方面，本申请提供了核酸分子，其编码如前述实施例中任一项所述的转录因子的一种或多种组分、任选地所有组分。
15、在另一方面，本申请提供了包含核酸分子的载体。在一些实施例中，载体包含与编码dna结合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种转录因子，其包含DNA结合结构域和至少三个转录活化结构域(TAD)，其中所述TAD可以相同或不同。
2.如权利要求1所述的转录因子，其中所述TAD包含i)至少一个酸性TAD和至少一个富含Q的TAD，或ii)至少一个酸性TAD和至少一个富含P的TAD。
3.如权利要求2所述的转录因子，其中所述酸性TAD包含选自VP16、VP64、VP7、ATF6、TFE3、ATF6-11、或其片段的TAD的一个或多个拷贝。
4.如权利要求2所述的转录因子，其中所述富含Q的TAD包含选自Oct2-Q、SP1-Q1、或其片段的TAD的一个或多个拷贝。
5.如权利要求2所述的转录因子，其中所述富含P的TAD包含选自TFAP2-P、Oct2-P、或其片段的TAD的一个或多个拷贝。
6.如权利要求1或2所述的转录因子，其中所述TAD选自由以下组成的组：全长VP64、VP16的一个或多个重复、全长或部分p65、全长RTA、全长VP7、全长或部分TEF3、全长或部分ATF6-11、全长或部分酸性ATF6、全长或部分富含Q的SP1、全长或部分富含
7.如权利要求1-6中任一项所述的转录因子，其中所述TAD的总长度在长度上小于2000aa、小于1500aa、小于1000aa、小于750aa、小于500aa、小于300aa、小于250aa、小于200aa或小于150aa。
8.如权利要求1所述的转录因子，其中所述转录因子包含与SEQ ID NO:1-28中任一个具有至少95％序列同一性的序列，或与SEQ ID No:1-28具有至少80％、85％、90％、优选95％序列同一性的序列。
9.如权利要求1所述的转录因子，其中所述转录因子包含具有SEQ ID NO:1-18中任一个的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
10.如权利要求1所述的转录因子，其中编码所述转录因子的核酸序列包含SEQ ID No:30-47的序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列。
11.如权利要求1所述的转录因子，其中所述DNA结合结构域在有或没有接头的情况下与如权利要求1-10中任一项所述的转录因子连接。
12.如权利要求11所述的转录因子，其中所述DNA结合结构域直接或通过接头与所述转录因子的N末端连接。
13.如权利要求11所述的转录因子，其中所述DNA结合结构域直接或通过接头与所述转录因子的C末端连接。
14.如权利要求1-13中任一项所述的转录因子，其中所述DNA结合结构域与目的基因的基因组区域结合。
15.如权利要求14所述的转录因子，其中所述DNA结合结构域是gRNA/Cas复合物、转录活化因子样(TAL)效应子或锌指蛋白。
16.如权利要求15所述的转录因子，其中所述gRNA/Cas复合物包含Cas分子，所述Cas分子是或衍生自酿脓链球菌Cas9、空肠弯曲菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9或δ-变形菌(Dpb)CasX。
17.如权利要求16所述的转录因子，其中所述Cas分子缺乏一种或多种活性，任选地其中所述一种或多种活性是切割活性。
18.如权利要求16-17中任一项所述的转录因子，其中所述Cas分子由包含少于4,000个核苷酸的核酸分子编码，任选地其中所述Cas分子由包含少于3,500个核苷酸或少于2,500个核苷酸的核酸分子编码。
19.如权利要求16-18中任一项所述的转录因子，其中所述Cas分子是或衍生自金黄色葡萄球菌Cas9。
20.如权利要求19所述的转录因子，其中与野生型Cas分子序列相比，所述Cas分子包含一个或多个氨基酸的缺失。
21.如权利要求15所述的转录因子，其中所述DNA结合结构域是锌指蛋白。
22.如权利要求21所述的转录因子，其中所述DNA结合结构域与所述目的基因的启动子区域结合。
23.如权利要求22所述的转录因子，其中所述DNA结合结构域是锌指蛋白，所述锌指蛋白与所述目的基因的启动子区域的6、9、12、15、18、21或2...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种转录因子，其包含dna结合结构域和至少三个转录活化结构域(tad)，其中所述tad可以相同或不同。
2.如权利要求1所述的转录因子，其中所述tad包含i)至少一个酸性tad和至少一个富含q的tad，或ii)至少一个酸性tad和至少一个富含p的tad。
3.如权利要求2所述的转录因子，其中所述酸性tad包含选自vp16、vp64、vp7、atf6、tfe3、atf6-11、或其片段的tad的一个或多个拷贝。
4.如权利要求2所述的转录因子，其中所述富含q的tad包含选自oct2-q、sp1-q1、或其片段的tad的一个或多个拷贝。
5.如权利要求2所述的转录因子，其中所述富含p的tad包含选自tfap2-p、oct2-p、或其片段的tad的一个或多个拷贝。
6.如权利要求1或2所述的转录因子，其中所述tad选自由以下组成的组：全长vp64、vp16的一个或多个重复、全长或部分p65、全长rta、全长vp7、全长或部分tef3、全长或部分atf6-11、全长或部分酸性atf6、全长或部分富含q的sp1、全长或部分富含q的oct2、全长或部分富含p的oct2、全长或部分富含p的tfap2、vp64的活性片段、p65的转录活性片段、rta的转录活性片段、vp7的活性片段、tef3的活性片段、atf6-11的活性片段、酸性atf6的活性片段、富含q的sp1的活性片段、富含q的oct2的活性片段、富含p的oct2的活性片段、富含p的tfap2的活性片段、及其任何组合。
7.如权利要求1-6中任一项所述的转录因子，其中所述tad的总长度在长度上小于2000aa、小于1500aa、小于1000aa、小于750aa、小于500aa、小于300aa、小于250aa、小于200aa或小于150aa。
8.如权利要求1所述的转录因子，其中所述转录因子包含与seq id no:1-28中任一个具有至少95％序列同一性的序列，或与seq id no:1-28具有至少80％、85％、90％、优选95％序列同一性的序列。
9.如权利要求1所述的转录因子，其中所述转录因子包含具有seq id no:1-18中任一个的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
10.如权利要求1所述的转录因子，其中编码所述转录因子的核酸序列包含seq id no:30-47的序列，或与其具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列。
11.如权利要求1所述的转录因子，其中所述dna结合结构域在有或没有接头的情况下与如权利要求1-10中任一项所述的转录因子连接。
12.如权利要求11所述的转录因子，其中所述dna结合结构域直接或通过接头与所述转录因子的n末端连接。
13.如权利要求11所述的转录因子，其中所述dna结合结构域直接或通过接头与所述转录因子的c末端连接。
14.如权利要求1-13中任一项所述的转录因子，其中所述dna结合结构域与目的基因的基因组区域结合。
15.如权利要求14所述的转录因子，其中所述dna结合结构域是grna/cas复合物、转录活化因子样(tal)效应子或锌指蛋白。
16.如权利要求15所述的转录因子，其中所述grna/cas复合物包含cas分子，所述cas分子是或衍生自酿脓链球菌cas9、空肠弯曲菌cas9、金黄色葡萄球菌cas9或δ-变形菌(dpb)...
【专利技术属性】
技术研发人员：K·E·弗格森，S·V·赫罗马德卡，陶旭，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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