本发明专利技术涉及能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物(I)及其应用。本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术提供了一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物(HT琥珀酸酯)及其应用，采用HT标记的探针能够有效的甄别DPYD*9A位点野生型和突变型模板，可用于检测消化系统肿瘤，具有重要应用前景。
【技术实现步骤摘要】
能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物及其应用(一)
本专利技术涉及一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物及其应用。(二)
技术介绍
实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。目前有下面几种常用的荧光定量方法：TaqMan探针、Beacon探针、FRET技术等。MGB探针是在TaqMan探针基础上研发的一种探针修饰方法，该探针是指带有一个小沟结合物基团的DNA探针，它可与单链的靶DNA形成极为稳定的异源双链，同时这种探针相对于通常的探针序列更短一些。研究表明，一般情况下，同MGB-寡核苷酸形成的错配异源双链其熔点温度比没有MGB的寡核苷酸形成的双链熔点温度高，而且由于ΔTm(完全匹配的Tm值与错配的Tm值之差)由错配的位置和类型决定，在小沟结合区内形成的错配特别不稳定。比起通常的寡核苷酸探针，MGB寡核苷酸探针更容易辨认在MGB结合区形成的错配。同时分子分析表明，与寡核苷酸探针3′连接的MGB可向探针的5′－末端滑行1-2bp，以便有更好的小沟结合位。MGB结构连接到12-18mer的寡核苷酸时，能显著增加异源双链的稳定性。据报道，Tm值在66-70℃之间，而没有MGB的相同序列Tm值在44～56℃。探针越短，整体异源双链的稳定性越大。有研究表明，一个没有MGB的27mer寡核苷酸探针形成的异源双链的稳定性(Tm＝65℃)与有MGB的12mer寡核苷酸探针(Tm＝66℃)相同，从这12mer的寡核苷酸探针的序列中可以看出，富含A/T的3′－末端附近的MGB配体对稳定性的作用等于在序列的5′－末端另加15个mer。目前的MGB探针是MGB结构连接在3’端的淬灭基团上，而且结构单一的使用了DPI3，因次，目前的MGB探针不适合做多重荧光定量检测，另外针对不同基因设计的灵活性不够高，造成很多地方应用的局限性。但是MGB探针虽然可以提高探针的Tm值，但是大部分情况下会抑制PCR的扩增，因此，需要寻找一种新的方法，对PCR扩增不产生影响且可以提高探针的Tm值。(三)
技术实现思路
本专利技术目的即是提供一种提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物，及其在提高寡核苷酸链Tm值中的应用。本专利技术采用的技术方案是：一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物(Hoechst33258-琥珀酸酯，以下简称HT琥珀酸酯)，所述化合物结构如式(I)所示：该标记化合物能直接嵌入DNA双螺旋结构或者能够与DNA双螺旋结构中的小沟结合从而形成稳定DNA的双螺旋，从而提高被修饰的寡核苷酸链的Tm值。本专利技术还涉及所述标记化合物在提高寡核苷酸链Tm值中的应用。具体的，所述应用方法如下：(1)将所述标记化合物与带有氨基的寡核苷酸按照摩尔比1～30：1溶于pH7～10的碳酸氢钠水溶液中，在20～60℃下进行反应1～48小时，得到带有标记化合物的寡核苷酸粗产物；(2)将步骤(1)得到的粗产物采用沉淀、PAGE或者高效液相方法进行纯化，得到纯化后的带有标记化合物的寡核苷酸，即Tm值提高后的寡核苷酸链。进一步，所述Tm值提高后的寡核苷酸链可用于检测消化系统肿瘤，采用该Tm值提高后的寡核苷酸链，能有效的甄别野生型和突变型模板。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物(HT琥珀酸酯)及其应用，采用HT琥珀酸酯标记的探针能够有效的甄别DPYD*9A位点野生型和突变型模板，可用于检测消化系统肿瘤，具有重要应用前景。(四)附图说明图1为采用HT琥珀酸酯标记的荧光定量PCR探针检测DPYD*9A位点(T85C)的检测图；其中，A：野生型模板检测结果；B：突变型模板检测结果；图2为采用MGB标记的荧光定量PCR探针检测DPYD*9A位点(T85C)的检测图；其中，A：野生型模板检测结果；B：突变型模板检测结果；图3为采用TaqMan标记的荧光定量PCR探针检测DPYD*9A位点(T85C)的检测图；其中，A：野生型模板检测结果；B：突变型模板检测结果；图4为采用LNA标记的荧光定量PCR探针检测DPYD*9A位点(T85C)的检测图；其中，A：野生型模板检测结果；B：突变型模板检测结果。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：合成标记化合物一种提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物，该标记化合物为一种琥珀酸酯，简称HT琥珀酸酯，HT琥珀酸酯的制备步骤为：将1.8gHoechst33258与1.48g碳酸钾溶解在20mlDMF中，加入0.8ml4-溴丁酸乙酯，将反应混合物在60℃加热12小时，冷却，过滤，旋蒸，剩余物质溶解在甲醇中，用硅胶柱纯化，甲醇和二氯甲烷最为洗脱剂，得到的产品用乙醇重结晶得到hoechst33258-O-丁酸乙酯1.4g。1HNMR(DMSO-d6)δ1.19(3H),2.03(2H,m),2.45(2H,m),2.90(3H),3.08and3.16(4H,m),3.90(4H,m),4.08-4.12(4H,m),7.21(3H,m),7.34(1H,m),7.73(1H,d),7.94(1H,d),8.14(1H,m),8.24(2H,m),8.57(1H,s).将1.3ghoechst33258-O-丁酸乙酯放入5ml1MNaOH和5ml乙醇中，加热到60℃1h，反应混合物冷却然后用10％的盐酸酸化到pH为4，产物析出，过滤，滤饼用水，丙酮和乙醚洗涤，干燥的到hoechst33258-O-丁酸。1HNMR(DMSOd6)δ1.99(2H,m),2.42(2H,t),2.45(3H,s),2.84(4H,m),3.44(4H,s),4.10(2H,t),6.99(1H,d),7.11(3H,m),7.50(1H,d),7.66(1H,m),8.06(1H,d),8.24(2H,d),8.40(1H,s).琥珀酸酯的合成：将0.43ghoechst33258-O-丁酸溶解在5mlDMF中，加入0.68ml三乙胺，然后加入0.31gTSTU，室温反应1h后倒入石油醚中，过滤，得到产物hoechst33258-琥珀酸酯0.3g。1HNMR(DMSOd6)δ1.99(2H,m),2.42(2H,t),2.45(3H,s),2.64(4H,m)，2.84(4H,m),3.44(4H,s),4.10(2H,t),6.99(1H,d),7.11(3H,m),7.50(1H,d),7.66(1H,m),8.06(1H,d),8.24(2H,d),8.40(1H,s).实施例2：带有标记化合物的寡核苷酸的合成与纯化提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物的标记方法，主要包括以下步骤：(1)将Hoechst33258-琥珀酸酯(化合物结构式I)5mg溶解在3mlDMF(二甲基甲酰胺)与3ml0.1MNaHCO3中，加入3.2mgamino修饰的寡核苷酸(C*TGCTCCCCGCGT*G和C*TGCTCCCCCCGT*G，其中*为氨基修饰)25℃反应2小时，可得到带有标记本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物，所述化合物结构如式(I)所示：
【技术特征摘要】
1.一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物，所述化合物结构如式(I)所示：2.如权利要求1所述标记化合物在提高寡核苷酸链Tm值中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用方法如下：(1)将所述标记化合物与带有氨基的寡核苷酸按照摩尔比1～30：1溶于pH7～10的碳酸氢钠水溶液中，在2...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴李鸣，殷胜勇，张乐乐，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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