一种改善烟叶品质的食源性乳酸菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种改善烟叶品质的食源性乳酸菌及其制备方法和应用，属于应用微生物技术领域。本发明专利技术从酸萝卜中筛选得到一种能在烟叶为唯一营养源的乳酸菌，分类命名为植物乳杆菌（

A food borne lactobacillus to improve the quality of tobacco and its preparation and Application

The invention discloses a food borne lactic acid bacteria which improves the quality of tobacco leaves and its preparation method and application, which belongs to the field of applied microbiological technology. A lactic acid bacterium, which can be used as the only nutrient source in the tobacco leaf, is selected from the acid radish, and is classified and named Lactobacillus plant (Lactobacillus plant).

【技术实现步骤摘要】
一种改善烟叶品质的食源性乳酸菌及其制备方法和应用
本专利技术属于应用微生物
，具体涉及一种能改善卷烟品质的食源性植物乳杆菌及其制备方法和应用。
技术介绍
烟叶陈化，即烟叶发酵，是在一定温度和湿度条件下，烟叶理化特性发生深刻变化，烟叶香气、色泽和吸味品质明显改善的一个重要卷烟生产加工过程。烟叶陈化分为自然陈化和人工陈化。人工陈化速度快，但发酵后烟叶内各种成分比例不协调，至今已经很少采用。自然陈化发酵效果好，但耗时长，场地占用大、资金积压多，导致生产成本提高。另外，在长期仓储陈化过程中，烟叶易霉变和长虫，给烟草企业造成严重的经济损失。陈化烟叶表面存在大量微生物群落，这些微生物在生长代谢过程中吸收烟叶的营养物质，同时通过1)向外分泌各种不同酶类，将烟叶表面的大分子物质(蛋白质、纤维素、淀粉等)降解为氨基酸、醇、酯、有机酸等小分子物质，或者2)诱导烟叶表面其他酶系的代谢，最终影响卷烟吸食品质。所以，模拟烟叶陈化过程，将特定微生物单独或混合接种于烟叶，进行发酵，能使烟叶化学成分比例更加协调，烟香和烟气增加，刺激性降低，吸食味改善，烟叶品质显著提升。目前，用于烟叶发酵的微生物大多分离自烟叶表面或土壤，有些是条件致病菌，存在一定安全隐患。乳酸菌是公认的食品级安全微生物，广泛应用于酸奶、果汁、馒头等食品的风味塑造。另外，乳酸菌通过分泌乳酸、细菌素等代谢产物抑制一些病原细菌和真菌。所以将食源性乳酸菌应用于烟叶发酵，不仅能缩短烟叶发酵时间，提升烟叶质量和吸食品质，更能降低抽吸卷烟造成的不安全性，在卷烟制造行业具有巨大应用潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种食源性植物乳杆菌及其制备方法。本专利技术的第二目的在于提供上述食源性菌株的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供所述食源性植物乳杆菌在卷烟生产中的应用。本专利技术的技术方案如下：所述食源性植物乳杆菌分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L15，已于2017年8月28日保藏在中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏号为CCTCCM2017459。上述食源性植物乳杆菌L15的分离筛选方法为：从湖南怀化采集酸萝卜样品若干份，利用改良MRS固体培养基筛选乳酸菌，单菌落在MRS液体培养基中过夜培养后，保存于-80℃冰箱中，随机选取几株乳酸菌，在烟叶培养基中划线分离，37℃培养48h，筛选分离得到了一株能以烟叶为唯一营养源的植物乳杆菌。所述的烟叶培养基的配制方法：将品种为K326、具有1年陈化龄、由云南中烟工业有限责任公司原料部提供的烟叶磨成粉末，称取0.7-1.1g粉末和1.8g琼脂，用水调节至100mL，115℃灭菌20min，即得烟叶培养基。所述的食源性植物乳杆菌在制备烟丝发酵菌剂中的应用，按以下进行：用上述植物乳杆菌L15制备一种发酵制剂，其制备方法为：用植物乳杆菌L15在MRS培养基活化14-16h，按4-8‰单位v/v接种于100mLMRS液体培养基中，30-37℃静置培养20-24h，8000-10000rpm，20-25min离心沉淀菌体，采用无菌去离子水洗涤2-3次菌体后，加入无菌去离子水制成浓度为108-1010CFU/mL菌悬液，即发酵菌剂。所述的食源性植物乳杆菌在改善卷烟吸食品质中的应用，称取含水率为10-11％的烟丝20-25g，喷施5-6mL上述菌悬液，装入无菌食品袋中，于恒温恒湿培养箱中发酵7-14天，恒温为28-30℃，恒湿为50-60％湿度，将烟丝制成卷烟，即可。所述发酵菌剂浓度为109CFU/mL、发酵温度37℃、菌龄20h，这是最适发酵产香的条件。本专利技术所用到的发酵烟丝为从商品化云烟紫云中抽出的烟丝。与现有技术相比，本专利技术具有以下突出的优点：(1)本专利技术提供了一种改善卷烟品质的食源性植物乳杆菌L15；(2)本专利技术提供了所述植物乳杆菌L15在改善卷烟品质中的最优发酵产香条件；(3)本专利技术所述植物乳杆菌L15发酵烟丝后，香气质提升，烟气柔和，杂气、刺激性和苦辣味减弱，酸香味突显，余味改善；烟叶的化学成分更加协调；致香成分发生了改变；(4)由于所述植物乳杆菌L15安全性和对病原菌的抑制性，能降低抽吸卷烟的危险系数，在卷烟制造行业具有巨大应用潜力。附图说明图1为植物乳杆菌L15的生长和产酸曲线。CFU表示菌落形成单位(colonyformingunit)。植物乳杆菌分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L15，保藏日期2017年8月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；；地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCM2017459。具体实施方式为了使本说明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本说明作进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所述实验结果，如无特殊说明，均为三次重复的平均值。实施例1：一、植物乳杆菌L15的分离和鉴定从云南各州县采集豆豉样品若干份，利用改良MRS固体培养基筛选乳酸菌，单菌落在MRS液体培养基中静置过夜培养后，保存于-80℃冰箱中。随机选取6株乳酸菌，在烟叶培养基中划线分离，37℃培养48h。选取1株长势最好菌株，命名为L15，接种于MRS固体培养基，37℃培养48h后，观察菌落形态，并按照常规细菌鉴定方法进行生理生化特性分析。利用细菌基因组提取试剂盒提取L15基因组DNA，用16SrDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增L1516SrDNA基因，并送往昆明硕擎生物技术有限公司进行测序。PCR扩增条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，32个循环；72℃5min。序列信息提交至NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行在线比对分析。在改良MRS固体平板上，菌落颜色为乳白色或淡黄色，菌落周围有明显溶钙圈，溴甲酚紫变为黄色，这些单菌落初步确定为乳酸菌。在6株乳酸菌中，L15在烟叶培养基中长势最好。其形态和生理生化特征为：短杆状，无鞭毛，革兰氏染色、葡萄糖产酸和β-半乳糖甙酶活性呈阳性，过氧化氢酶、明胶液化和V-P实验呈阴性。分子生物学鉴定分析显示，PCR产物长度为1441bp，与NCBI数据库中的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)具有很高的同源性(>99％)。基于这些结果，将L15鉴定为植物乳杆菌。植物乳杆菌L1516SrDNA序列如SEQIDNO:1所示。所述的改良MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉粉8，酵母粉4，葡萄糖20，吐温-801，K2HPO42，NaAc5，MgSO40.2，MnSO40.05，柠檬酸三铵2，CaCO310，溴甲酚紫0.04，琼脂15，115℃灭菌20min。所述的MRS固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉粉8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，吐温-801g/L，K2HPO42g/L，NaAc5g/L，MgSO40.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食源性植物乳杆菌，其特征在于：该菌株分类命名为植物乳杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种食源性植物乳杆菌，其特征在于：该菌株分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）L15，保藏号为CCTCCM2017459。2.权利要求1所述的食源性植物乳杆菌的制备方法，其特征在于按以下进行：从湖南怀化采集酸萝卜样品若干份，利用改良MRS固体培养基筛选乳酸菌，单菌落在MRS液体培养基中过夜培养后，保存于-80℃冰箱中，随机选取几株乳酸菌，在烟叶培养基中划线分离，37℃培养48h，筛选分离得到了一株能以烟叶为唯一营养源的植物乳杆菌；所述的烟叶培养基的配制方法：将品种为K326、具有1年陈化龄、由云南中烟工业有限责任公司原料部提供的烟叶磨成粉末，称取0.7-1.1g粉末和1.8g琼脂，用水调节至100mL，115℃灭菌20min，冷却倒平板，备用。3.权利要求1所述的食源性植物乳杆菌在制备烟丝发酵菌剂中的应用。4.根据权利要求3所述的食源性植物乳杆菌在制备烟丝发酵菌剂中的应用，其特征在于按以下进行：用上述植物乳杆菌L15制备一种发酵制剂，其制备方法为：用植物乳杆菌L15在MRS培养基活化14-16h，按4-8‰单位v/v接种于100mLMRS液体培养基中，30-37℃静置培养20-24h，8000-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐玉琼，罗义勇，米其利，刘彪，徐济仓，陈建华，楼牧梦，夭建华，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53