一种从枸杞子中提取多糖的方法技术

本发明专利技术涉及一种从枸杞子中提取的多糖、多糖的提取方法、和在制备阿尔兹海默症药物的应用，具体涉及一种从枸杞子中提取多糖LBP1C‑2的方法，包括先从枸杞子中提取酶‑水联提枸杞粗多糖，再对粗多糖进行纯化，得到多糖LBP1C‑2；后经过酸水解、甲基化和核磁共振分析，确定多糖LBP1C‑2为一果胶；并经过体外实验表明多糖LBP1C‑2能够剂量依赖性抑制稳定转染APP和BACE1的CHO/APPBACE1细胞和稳定转染APP Switish突变的HEK293‑APP

A method of extracting polysaccharides from Lycium barbarum

The invention relates to a medlar extract polysaccharides, extraction method, and in the preparation of Alzheimer's drug application, in particular relates to a method for extracting polysaccharides from Lycium LBP1C 2, including the first enzyme extraction water extract of Lycium barbarum polysaccharides from Lycium barbarum L. then, the crude polysaccharide was purified by LBP1C polysaccharide 2; after acid hydrolysis, methylation and NMR analysis, determination of polysaccharide LBP1C 2 is a pectin; and after in vitro experiments indicated that polysaccharide LBP1C 2 can dose dependently inhibit the stable transfection of APP and BACE1 in CHO/APPBACE1 cells and stable transfection of APP Switish mutant HEK293 APP

【技术实现步骤摘要】
一种从枸杞子中提取多糖的方法
本专利技术涉及多糖提取领域，具体涉及一种从枸杞子中提取多糖的方法。
技术介绍
阿尔兹海默症亦称早老性痴呆，是一种渐进性的神经退行性疾病，主要临床表现为记忆力逐渐减退、认知功能发生障碍、行为异常和社交障碍等。随着人口老龄化的不断加剧，阿尔兹海默症的发病率也逐年升高，已成为最受公众关注的重要健康问题之一。β-淀粉样蛋白在脑内的沉积和异常表达是目前认为引发阿尔兹海默症的核心环节，以β-淀粉样蛋白为作用靶点，通过干扰APP代谢，从源头上减少β-淀粉样蛋白的产生，是目前治疗阿尔兹海默症的研究热点。枸杞属于茄科落叶灌木，其橙红色椭球形浆果为枸杞子，常被用作中药和功能性食品，且主要分布在我国的北部。枸杞多糖作为其中主要的活性成分，具有抗肿瘤、降血糖，免疫调节等作用。但枸杞多糖在治疗阿尔兹海默症的作用，尚无报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从枸杞子中提取多糖的方法，简单有效，药理实验表明制得的多糖能够明显抑制可以剂量依赖性地抑制稳定转染APP和BACE1的CHO/APPBACE1细胞中和稳定转染APPSwitish突变的HEK293-APPsw细胞中Aβ42的生成，并且能明显抑制Aβ42的聚集；具有治疗阿尔兹海默症的作用，可开发成为一种治疗阿尔兹海默症的糖类药物。本专利技术多糖的结构如下：其中，n为2-120的整数。上述多糖LBP1C-2，其重均分子量的范围为12-720kDa，进一步地，上述多糖LBP1C-2的重均分子量为50-100kDa。上述多糖LBP1C-2的单糖组成包括阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和鼠李糖，其中阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和鼠李糖的质量比为57.03:26.53:8.25:8.18。本专利技术采用了以下技术方案：一种从枸杞子中提取多糖的方法，包括以下步骤：(1)多糖提取：将干燥的枸杞果实粉碎，加入15-30倍重量的去离子水混匀；之后在55-60℃条件下，分别加入枸杞重量3％的纤维素酶、枸杞重量1％的淀粉酶及枸杞重量0.5％的木瓜蛋白酶进行提取1h；之后升温使酶失活，经过离心、滤液浓缩、透析、再浓缩操作，加入5倍于浓缩液体积的95％乙醇，离心后得沉淀；所得沉淀再经无水乙醇与丙酮交替洗涤各3次，最后经真空干燥得酶-水联提枸杞粗多糖；(2)多糖纯化：取酶-水联提枸杞粗多糖，加10-15倍重量的水溶解，离心，上清液经DEAE阴离子交换柱进行分级纯化，依次用H2O、0.05MNaCl、0.1MNaCl、0.2MNaCl洗脱，之后收集0.2MNaCl洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得到初步纯化的多糖LBP1C；将所得的多糖LBP1C溶于0.2MNaCl中，离心，上清液经SephacrylHRS-300柱分离，收集洗脱组分，进行浓缩、透析、冷冻干燥处理，得到多糖LBP1C-2。上述方法提取的多糖在治疗阿尔兹海默症药物的应用，药理实验表明上述多糖可以剂量依赖性地抑制稳定转染APP和BACE1的CHO/APPBACE1细胞中和稳定转染APPSwitish突变的HEK293-APPsw细胞中Aβ42的生成，并且所述多糖能明显抑制Aβ42的聚集；同时具有治疗阿尔兹海默症的作用，能开发成治疗阿尔兹海默症的糖类药物。附图说明图1A为多糖LBP1C-2的特征13CNMR图谱；图1B为多糖LBP1C-2的DEPT135图谱；图2为多糖LBP1C-202I的特征HMBC图谱；图3为多糖LBP1C-2的特征HMBC图谱；图4A为多糖LBP1C-2抑制CHO/APPBACE1细胞中Aβ42分泌量的柱状图；图4B多糖LBP1C-2抑制HEK293-APPsw细胞中Aβ42分泌量的柱状图；图5为多糖LBP1C-2对CHO/APPBACE1细胞活力影响的折线图；图6为多糖LBP1C-2抑制Aβ42的聚集的折线图。具体实施方式为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行具体说明。应当理解，以下文字仅仅用以描述本专利技术的一种或几种具体的实施方式，并不对本专利技术具体请求的保护范围进行严格限定。实施例一种从枸杞中提取多糖的方法，包括如下步骤：(1)多糖提取：将干燥的枸杞果实1000g经粉碎机粉碎，加入20L的去离子水，在55℃下，分别加入30g的纤维素酶、10g的淀粉酶及5g的木瓜蛋白酶提取1h，后将温度升至100℃使酶失活，使用GM-21离心机在8000rpm/min条件下离心15min，弃去沉淀，滤液浓缩至小体积，再用分子截留量为3500Da的透析袋对流动水透析3天，将透析内液加热浓缩至3L，离心弃去沉淀，将上清液在搅拌下加入15L的95％乙醇，静置过夜，离心得沉淀，所得沉淀经无水乙醇与丙酮交替洗涤各3次，离心分离，沉淀置于50℃下真空干燥，得酶-水联提枸杞粗多糖25.8g；(2)多糖纯化：取上述制备的酶-水联提枸杞粗多糖6g，加60mL的去离子水溶解，4000r/min离心10min除去不溶物，取上清液经DEAESepharoseTMFastFlow阴离交换柱进行初步分级纯化，依次H2O、0.05MNaCl、0.1MNaCl、0.2MNaCl洗脱，硫酸-苯酚检测，并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并0.2MNaCl洗脱组分，使用1000mL的圆底烧瓶盛装0.2M洗脱组分，用旋转蒸发仪进行浓缩，并使用分子截留量为3500Da的透析袋对去离子水透析3天，后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到初步纯化的多糖LBP1C；取200mg多糖LBP1C溶于2mL的0.2MNaCl中，4000r/min离心10min，取上清液经SephacrylHRS-300凝胶色谱柱分离，再以0.2MNaCl洗脱并控制流速在3-6mL/15min。硫酸-苯酚法检测，在490nm波长下绘制洗脱曲线，从洗脱曲线得5个吸收峰，收集合并第二个吸收峰经HPGPC检测，重均分子量在12-720kDa且为单一对称的吸收峰即为组分多糖LBP1C-2，经过浓缩，透析，冷冻干燥，得枸杞多糖LBP1C-2约35mg。结构鉴定及解析将实施例1得到的多糖LBP1C-2进行结构鉴定及解析：①采用高效凝胶渗透色谱系统，UltrahydrogelTM2000(25cm×0.75cm，美国Waters公司)；和UltrahydrogelTM500(25cm×0.75cm，美国Waters公司)串联柱，以用不同分子量的T-系列标准葡聚糖(Dextran)制作标准曲线；设定柱温为40℃，以0.1MNaNO3作为流动相，流速为5ml/min，多糖LBP1C-2样品浓度为2mg/ml，测定多糖LBP1C-2的分子量。经测定多糖LBP1C-2相对分子质量为99.8kDa。将其进行单糖组成分析，即将多糖完全水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后送入气相色谱分析。单糖组成分析结果显示，多糖LBP1C-2主要含有阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖和半乳糖醛酸。结合部分酸水解、甲基化和核磁共振分析，如图1、图2、图3，确定LBP1C-2为一果胶。②单糖组成分析表明多糖LBP1C-2的单糖组成为：阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和鼠李糖的质量比为57.03:26.53:8.25:8.18。③多糖的部分酸水解：取200mg多糖LBP1C-2溶解于20mL的0.2MCF3COOH中，密封后于1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从枸杞子中提取多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)多糖提取：将干燥的枸杞果实粉碎，加入15‑30倍重量的去离子水混匀；之后在55‑60℃条件下，分别加入枸杞重量3％的纤维素酶、枸杞重量1％的淀粉酶及枸杞重量0.5％的木瓜蛋白酶进行提取1h；之后升温使酶失活，经过离心、滤液浓缩、透析、再浓缩操作，加入5倍于浓缩液体积的95％乙醇，离心后得沉淀；所得沉淀再经无水乙醇与丙酮交替洗涤各3次，最后经真空干燥得酶‑水联提枸杞粗多糖；(2)多糖纯化：取酶‑水联提枸杞粗多糖，加10‑15倍重量的水溶解，离心，上清液经DEAE阴离子交换柱进行分级纯化，依次用H2O、0.05M NaCl、0.1M NaCl、0.2MNaCl洗脱，之后收集0.2M NaCl洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得到初步纯化的多糖LBP1C；将所得的多糖LBP1C溶于0.2MNaCl中，离心，上清液经Sephacryl HR S‑300柱分离，收集洗脱组分，进行浓缩、透析、冷冻干燥处理，得到多糖LBP1C‑2。

【技术特征摘要】
1.一种从枸杞子中提取多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)多糖提取：将干燥的枸杞果实粉碎，加入15-30倍重量的去离子水混匀；之后在55-60℃条件下，分别加入枸杞重量3％的纤维素酶、枸杞重量1％的淀粉酶及枸杞重量0.5％的木瓜蛋白酶进行提取1h；之后升温使酶失活，经过离心、滤液浓缩、透析、再浓缩操作，加入5倍于浓缩液体积的95％乙醇，离心后得沉淀；所得沉淀再经无水乙醇与丙酮交替洗涤各3次，最后经真空干燥得酶-水联提枸杞粗多糖；(2)多糖纯化：取酶-水联提枸杞粗多糖，加10-15倍重量的水溶解，离心，上清液经DEAE阴离子交换柱进行分级纯化，依次用H2O、0.05MNaCl、0.1MNaCl、0.2MNaCl洗脱，之后收集0.2MNaCl洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得到初步纯化的多糖LBP1C；将所得的多糖LBP1C溶于0.2MNaCl中，离心，上清液经SephacrylHRS-300柱分离，收集洗脱组分...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁侃，周立爽，
申请(专利权)人：贵州中科健生物医药有限公司，遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52