一种促凝血女贞花多糖及其提取分离方法和应用技术

本发明专利技术属于植物提取技术领域，具体涉及一种促凝血女贞花多糖及其提取分离方法和应用。该提取分离方法是将女贞花经脱脂、水提醇沉获得粗多糖，然后将除蛋白、脱色后的粗多糖用DEAE‑52纤维素色谱柱、Sephadex G‑100凝胶色谱柱进一步纯化而得。本发明专利技术对该多糖的体外凝血效果进行考察，结果表明该多糖有良好的促凝血作用，可用于制备促凝血药物。

A method and application of extraction and separation of Polysaccharides from Ligustrum lucidum

The invention belongs to the field of plant extraction technology, in particular to a kind of procoagulant Ligustrum lucidum polysaccharide and its extraction and separation method and application. The extraction method is the Ligustrum flower after degreasing, water extraction and alcohol precipitation to obtain crude polysaccharide, then in addition to the crude polysaccharide protein and decolorized by DEAE cellulose 52 chromatography and Sephadex G gel column 100 further purification and. The present invention has studied the effect of the polysaccharide in vitro, and the results show that the polysaccharide has good procoagulant effect and can be used in the preparation of procoagulant drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种促凝血女贞花多糖及其提取分离方法和应用
本专利技术属于植物提取
，具体涉及一种促凝血女贞花多糖及其提取分离方法和应用。
技术介绍
女贞（LigustrumlucidumAit）为木犀科女贞属植物，产于长江以南至华南、西南各省区，向西北分布至陕西、甘肃，朝鲜也有分布，印度、尼泊尔有栽培。其干燥果实为女贞子，有滋肝补肾、乌专利技术目的功效。目前，国内外一些研究者对女贞子的炮制方法、药理作用、化学成分等有深入的研究，化学研究表明其含有多糖类、有机酸、萜类、甾体类和黄酮类等活性成分，具有抗炎、降血糖、提高机体免疫力和保肝等作用，而对女贞花的研究则仅限于提取工艺、挥发油、黄酮类、萜类等，而关于女贞花多糖的研究未见报道，因此这不仅是在多糖领域的进步，同时也为女贞花的进一步开发利用提供了广阔的前景。凝血实质上是水溶性的纤维蛋白原转变为水不溶性的固态纤维蛋白的过程，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后在凝血酶的作用下使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。血浆凝血酶原时间（PT）主要反映的是外源性凝血途径中凝血因子I、II、V、VII、X的活性；部分活化凝血活酶时间（APTT）主要反映内源性凝血系统状况，与VIII、X、XI、XII等内源性凝血因子活性有关；凝血酶时间（TT）值是主要反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白程度的重要指标；血浆纤维蛋白原（FIB）主要反映纤维蛋白原的含量。能促进血液凝固而使出血停止的药物，称为止血药。临床上因各种病因引起的出血比较常见，如外科和矫形外科：胃肠道、肾、膀胱、前列腺及胸部手术；如创骨折出血、整容外科、颅脑肿痛、挫伤性出血等；内科：肝病出血，肿瘤出血、痔血、肺出血、鼻出血等；妇科手术：子宫及阴道息肉，肌瘤及肿瘤出血，放射治疗后出血；泌尿科：前列腺出血，前列腺切除、肾及膀胱出血等；耳鼻喉科：门诊小手术预防，扁桃体切除、喉部手术；牙科、口腔科：拔牙手术、腭部手术、齿龈炎出血。促凝血药是临床应用范围广泛的药物之一，在创伤中也有重要的应用价值，它主要通过增强体内凝血因素或抑制抗凝血因素，促使凝血，以达到止血目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从女贞花中提取分离得到具有促凝血作用的女贞花多糖，同时提供了该女贞花多糖的提取分离方法及应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种促凝血女贞花多糖的提取分离方法，其包括以下步骤：（1）新鲜的女贞花，阴干、粉碎，用石油醚回流脱脂，残渣挥干石油醚后，用乙醇浸提，所得残渣挥发至无醇味，再用超纯水加热提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩至原体积的1/4左右，再向浓缩液中加入乙醇，静置、离心，得到的沉淀加超纯水溶解透析以除去小分子杂质，透析液进行醇沉，得到的多糖沉淀冷冻干燥即得女贞花粗多糖；（2）取除蛋白、脱色后的女贞花粗多糖，用超纯水溶解、过滤后加入到DEAE-52纤维素色谱柱，依次用超纯水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/LNaCl溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，0.1mol/LNaCl溶液的洗脱峰为组分LL-1，0.2mol/LNaCl溶液的洗脱峰为组分LL-2、0.3mol/LNaCl溶液的洗脱峰为组分LL-3；（3）组分LL-1用超纯水溶解、过滤后加入到SephadexG-100凝胶色谱柱，用超纯水洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，在波长490nm处测其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为LLp-1b；LLp-1b即为促凝血女贞花多糖。其中，DEAE-52纤维素是一种弱酸性阴离子交换剂，主要是其可吸附离子型物质，比如蛋白质、酸性多糖等，而作为大多数的中性多糖则可顺利流出，从而去粗取精、达到分离的目的，常用于多糖的纯化。其中，SephadexG-100凝胶是一种半合成的凝胶，具有一定大小的孔径，不同形状和大小的多糖分子在凝胶层析柱中移动速度不同，从而使大分子多糖与小分子化合物，如盐类、色素、蛋白、小分子多糖等分离开，既可起到纯化多糖的目的，又可以用来鉴定多糖的纯度。利用上述的提取分离方法制备得到的促凝血女贞花多糖。上述的促凝血女贞花多糖在制备促凝血药物方面的应用。和现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术采用特殊的提取分离方法从女贞花中分离得到多糖LLp-1b，并对该多糖的体外凝血效果进行考察，结果表明该多糖有良好的促凝血作用，可用于制备促凝血药物，如促凝血剂。附图说明图1女贞花粗多糖DEAE-52纤维素柱色谱洗脱曲线；图2组分LL-1的SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱曲线；图3女贞花多糖LLp-1b紫外-可见光谱全波长扫描；图4标准单糖混合物的GC色谱图；图5为LLp-1b的水解物GC色谱图。具体实施方式以下通过具体实施方式，对本专利技术的
技术实现思路
再做进一步的详细说明，但是本专利技术的保护范围并不局限于此。下述实施例中，所用的材料女贞花采集于贵州省贵阳市花溪区湿地公园，为木犀科女贞属植物女贞LigustrumlucidumAit的花。本文中的乙醇浓度均为体积浓度。1、促凝血女贞花多糖的提取分离方法，包括以下步骤：（1）新鲜的女贞花在阴凉处阴干、粉碎（475g），用石油醚回流脱脂2次，每次2h，残渣挥干石油醚后，用70%乙醇室温浸提3次，每次3d，回收女贞花残渣，在通风橱中放置待其挥发至无醇味，然后用超纯水（料液比1g：12mL）于85℃加热提取2次，第一次5h、第二次4h。趁热用布氏漏斗抽滤，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/4左右，向浓缩后的溶液中加入无水乙醇至终浓度为70%，4℃静置12h，离心（6000r/min，10min）取其沉淀，沉淀干燥后加入超纯水溶解透析（装于透析袋中，36h，每2-4h换一次超纯水），透析时磁力搅拌以除去小分子杂质，然后透析液进行醇沉，得到的多糖沉淀冷冻干燥即得女贞花粗多糖。（2）将女贞花粗多糖用适量超纯水完全溶解获得粗多糖水溶液，按照粗多糖水溶液1/4体积的量加入Sevag试剂（氯仿：正丁醇=4:1，体积比），磁力搅拌震荡30min，放置使其自然分层，将最下层的溶剂和夹杂在上清液和溶剂之间的变性蛋白质清除，得到上清液，重复上述操作若干次直至没有变性蛋白层出现。将上清液减压浓缩后加入无水乙醇至终浓度为70%，4℃静置12h，离心后取其沉淀物干燥，即得除去蛋白的女贞花粗多糖。（3）步骤（2）所得除去蛋白的女贞花粗糖用适量超纯水完全溶解，向溶液中加入一定量的D101大孔树脂，在25℃、磁力搅拌器震荡24h，过滤，洗涤树脂，合并滤液，加入95%乙醇至终浓度为70%，4℃静置24h，离心后取其沉淀物干燥，即得脱色的女贞花粗多糖。（4）取步骤（3）脱色后的女贞花粗多糖，用超纯水溶解、过滤，加入到DEAE-52纤维素柱色谱，依次用超纯水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，BSZ-100自动部分收集器收集洗脱样品，每8min收集一管，采取苯酚-硫酸法进行多糖检本文档来自技高网...

【技术保护点】
促凝血女贞花多糖的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）新鲜的女贞花，阴干、粉碎，用石油醚回流脱脂，残渣挥干石油醚后，用乙醇浸提，所得残渣挥发至无醇味，再用超纯水加热提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入乙醇，静置、离心，得到的沉淀加超纯水溶解透析以除去小分子杂质，透析液进行醇沉，得到的多糖沉淀冷冻干燥即得女贞花粗多糖；（2）取除蛋白、脱色后的女贞花粗多糖，用超纯水溶解、过滤后加入到DEAE‑52纤维素色谱柱，依次用超纯水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L 的NaCl溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚‑硫酸法进行检测，测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，0.1 mol/L NaCl溶液的洗脱峰为组分LL‑1；（3）组分LL‑1用超纯水溶解、过滤后加入到Sephadex G‑100凝胶色谱柱，用超纯水洗脱，采用苯酚‑硫酸法进行检测，在波长490 nm处测其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为LLp‑1b；LLp‑1b即为促凝血女贞花多糖。...

【技术特征摘要】
1.促凝血女贞花多糖的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）新鲜的女贞花，阴干、粉碎，用石油醚回流脱脂，残渣挥干石油醚后，用乙醇浸提，所得残渣挥发至无醇味，再用超纯水加热提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入乙醇，静置、离心，得到的沉淀加超纯水溶解透析以除去小分子杂质，透析液进行醇沉，得到的多糖沉淀冷冻干燥即得女贞花粗多糖；（2）取除蛋白、脱色后的女贞花粗多糖，用超纯水溶解、过滤后加入到DEAE-52纤维素色谱柱，依次用超纯水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490nm处的吸光度，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：康文艺，尹震花，辛昕，张娟娟，
申请(专利权)人：黄河科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41