重组猪痘病毒和疫苗制造技术

本发明专利技术涉及新的重组猪痘病毒和其在疫苗组合物中的用途。本发明专利技术的重组猪痘病毒通过将一个或多个外源基因插入猪痘病毒的IL‑18结合蛋白(IL18bp)基因中产生。本发明专利技术特别适合于产生猪疫苗，特别是用于接种猪对抗PCV2感染。

Recombinant porcine pox virus and vaccine

The present invention relates to a new recombinant porcine pox virus and its use in a vaccine composition. The recombinant swine pox virus through one or more exogenous gene into swine pox virus IL 18 binding protein (IL18bp) gene in. The invention is especially suitable for producing swine vaccine, especially for inoculating pigs against PCV2 infection.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组猪痘病毒和疫苗本专利技术涉及新的重组猪痘病毒和其在疫苗组合物中的用途。本专利技术的重组猪痘病毒通过将一个或多个外源基因插入猪痘病毒的IL-18结合蛋白(IL18bp)基因中产生。本专利技术特别适合于产生猪疫苗，特别是用于接种猪对抗PCV2感染。
技术介绍
不同类型的病毒已经在本领域中提议作为用于基因递送或体内肽表达的载体。特别地，已经使用重组病毒例如痘病毒(OgawaR.等人,Vaccine,8:486-490(1990))、腺病毒(HSU,K.H.等人,Vaccine,12;607-612(1994))、杆状病毒以及疱疹病毒(Shin,M.-F.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:5867-5870(1984))制备了表达至少一种有关抗原的兽医疫苗。允许表达外源抗原的基因的具体病毒载体的实例包括Aujeszky病病毒(伪狂犬病病毒;PRV)(VanZijlM.等人,J.Virol.,65:2761-2765(1991))、火鸡疱疹病毒(HVT)(MorganR.W.等人,AvianDis.36:858-870(1992))和Marek病病毒(MDV)。基于疱疹病毒属的重组载体处于深入研究中。然而，本领域存在对可用于体内表达重组肽或蛋白的新病毒载体产品的需求。在此方面，痘病毒已经经工程改造以编码不同的多肽。一旦从感染的细胞释放入血液，痘病毒可感染其它细胞，因此潜在地导致升高的表达水平。重组痘病毒已经从不同类型的痘病毒产生，包括牛痘病毒、痘苗病毒和猪痘病毒(SPV)。然而，迄今为止，SPV重组体基本上通过将外源基因序列克隆入被认为对SPV存活非必需的基因区域即TK区域来产生(RichardW.Moyer,EladioVinuela,E.P.J.Gibbs,US5,651,972(1997))。本专利技术的专利技术人目前已经发现和验证了一个新的SPV基因插入区域，可将各种各样的外源基因序列插入其中。所得的重组SPV病毒允许有效和稳定表达克隆的基因序列，并且具有大克隆容量。此外，这些病毒在体内具有提高的免疫原性，并且可用于产生用于治疗任何哺乳动物特别是猪的治疗剂或疫苗。专利技术概述本专利技术涉及新的重组猪痘病毒及其用于基因递送和体内表达的用途，特别是在疫苗组合物中。本专利技术的重组猪痘病毒在猪痘病毒的IL-18结合蛋白(IL18bp)基因中包含一个或多个外源基因序列。本专利技术特别适合产生猪疫苗，特别是用于接种猪对抗PCV2感染。本专利技术的第一个目的因此涉及在其基因组中包含至少一个第一外源基因序列的重组猪痘病毒(rSPV)，其中所述第一外源基因序列插入rSPV基因组的IL18bp基因中。在一个具体的实施方案中，将外源基因序列插入置换所有或部分的病毒IL18bp基因序列。在另一个具体的实施方案中，本专利技术的rSPV进一步包含至少第二外源基因序列插入rSPV基因组的不同区域中，例如病毒胸苷激酶(TK)基因或锚蛋白重复序列(Ankyrinrepeat)蛋白基因中。本专利技术的另一个目的在于包含如上所定义的rSPV的基因组的核酸分子。本专利技术的另一个目的为包含本专利技术的rSPV或核酸分子的宿主细胞。本专利技术进一步提供用于产生rSPV的方法，包括感染或引入感受态细胞中如上所定义的核酸分子和收集rSPV。本专利技术还涉及用于繁殖rSPV的方法，包括感染感受态细胞如上所定义的rSPV和收集所述细胞产生的rSPV。本专利技术还涉及一种组合物，优选地兽医组合物，其包含如上所定义的rSPV或如上所定义的细胞或如上所定义的核酸分子以及赋形剂。本专利技术另一个目的为疫苗组合物，其包含如上所定义的rSPV或如上所定义的细胞或如上所定义的核酸分子、合适的赋形剂和任选的佐剂。本专利技术还涉及如上所定义的rSPV或细胞或核酸分子，用于将治疗剂递送给猪或接种肽或蛋白给猪。本专利技术还涉及如上所定义的rSPV或细胞或核酸分子，用于免疫或接种猪对抗病原体。本专利技术还涉及用于免疫猪的接种试剂盒，其包含下列组分：a.有效量的如上所定义的rSPV或疫苗，和b.用于将所述rSPV或疫苗给予所述猪的工具。本专利技术另一个目的涉及包含侧翼为与IL18bp基因序列同源的两个核酸序列的转基因的穿梭质粒或载体，所述侧翼序列允许穿梭质粒和SPV基因组之间同源重组。本专利技术可用于将任何外源基因序列递送和表达至哺乳动物，特别是猪。其特别适合于表达外源抗原以免疫或接种猪(例如，猪、小猪、母猪)。附图说明图1.同源质粒pSP92-Ess_ORF2的构建。图2.同源质粒pSP911-Ess_ORF2的构建。图3.亲本和重组SPV的基因组结构的说明。图4.纯化的SVR12和SVR13的蛋白质印迹。ESK-4细胞用亲本SPV(p)、SVR12克隆1H2C9D4G5(G5)或克隆2F5D5E5(E5)或SVR13克隆G2C2D4(D4)或克隆D10E5A5(A5)感染。6天后，将细胞裂解物应用于15%SDS-PAGE和使用大鼠抗ORF2(1:500)、生物素缀合的山羊抗大鼠IgG二抗(1:1000)和ABC-ALP(Vecterstain)的蛋白质印迹分析。M：分子量标志物。图5.PCR检查体外传代的rSPV。(A)PCR结果：PCR使用引物组SP7450F和SP8552R进行。各模板为SVR12克隆1H2C7F3E5(E5)、克隆2F5D5E5G5(G5)和SVR13克隆G2C2D4(D4)或克隆D10E5A5(A5)的体外传代+0或+15p的病毒DNA。转染时用于制造SVR12或SVR13的各转移质粒和pCR4-SPV6030/9574分别用作阳性对照(PC)或阴性对照(NC)的模板。分子量标志物为10kb(M1)和pHY。(B)亲本和rSPV的IL-18bp侧翼区域。黄色框为IL-18bp基因。图6.rSPV在Vero细胞中的相对生长将6孔板中的Vero细胞用三种重组SPV的每种即SVR3、SVR7或SVR12，以高(约0.01)或低(约0.001)MOI感染。感染后0、4、7、11和14天(DPI)，将各感染细胞和上清液用细胞刮棒收集，并冻融。对于病毒滴度，将这些细胞裂解物离心后连续稀释，感染入ESK-4细胞中并在37℃孵育1周以形成斑块。相对生长比根据各0DPI的滴度计算。专利技术详述本专利技术涉及新的重组猪痘病毒及其用途。本专利技术的重组猪痘病毒在猪痘病毒的IL-18结合蛋白(IL18bp)基因中包含一个或多个外源基因序列。如实验部分所示，这样的新SPV载体允许持续和有效的基因表达。此外，本专利技术的rSPV稳定并且可在体内产生改善的免疫应答。而且，令人惊讶地，本专利技术的SPV载体比先前的SPV更安全，因为其在哺乳动物细胞例如Vero细胞中不生长。这是包含缺失的IL18-bp基因的SPV病毒的首个报道，并且第一次证明外源基因序列可克隆入该位点，得到稳定的、免疫原性的和高生产的重组SPV载体。本专利技术的rSPV可进一步包含多于一个的外源基因序列，插入相同或不同的位置。其可单独使用或与其它重组病毒或抗原组合使用，以产生改善的疫苗。本专利技术特别适合于产生猪疫苗，特别是用于接种猪对抗PCV2感染。rSPV在本专利技术的语境中，重组猪痘病毒一般表示具有人工(例如，重组)工程改造的基因组的猪痘病毒。rSPV尤其包括在其基因组中包含外源遗传本文档来自技高网...

【技术保护点】
在其基因组中包含至少一个第一外源基因序列的重组猪痘病毒(rSPV)，其中所述第一外源基因序列插入rSPV基因组的IL‑18结合蛋白(IL18bp)基因中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.19 EP EP14307110.81.在其基因组中包含至少一个第一外源基因序列的重组猪痘病毒(rSPV)，其中所述第一外源基因序列插入rSPV基因组的IL-18结合蛋白(IL18bp)基因中。2.权利要求1的rSPV，其中将所述第一外源基因序列插入置换所有或部分的病毒IL18bp基因序列。3.权利要求2的rSPV，其中所述rSPV基因组包含至少100bp的IL18bp基因序列的缺失，并且所述第一外源基因序列位于所述缺失处。4.前述权利要求中任一项的rSPV，进一步包含插入rSPV基因组的不同区域中的至少第二外源基因序列，优选插入病毒胸苷激酶(TK)基因或锚蛋白重复序列蛋白基因中。5.前述权利要求中任一项的rSPV，其中所述第一和/或第二外源基因序列编码抗原，优选PCV2抗原。6.前述权利要求中任一项的rSPV，其中所述第一或第二外源基因序列编码PCV2衣壳抗原，优选PCV2ORF2蛋白或肽。7.前述权利要求中任一项的rSPV，其中各所述第一和/或第二外源基因序列包含转录启动子。8.权利要求7的rSPV，其中所述启动子选自痘苗病毒7.5-k...

【专利技术属性】
技术研发人员：T佐藤，
申请(专利权)人：法国诗华动物保健公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR