伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用制造技术

本发明专利技术属于动物病毒学及基因工程学技术领域，具体涉及一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用。所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株是由伪狂犬病毒强毒株PRV AH‑China‑2013株进行毒力基因gE和gI的部分缺失制成。本发明专利技术在上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株PRV AH gI

Construction and application of gI/gE gene deletion mutant of pseudorabies virus epidemic strain

The invention belongs to the field of animal virology and gene engineering technology, in particular relates to a pseudorabies virus epidemic strain gI/gE gene deletion mutant and its construction and application. The mutant is made of pseudorabies virus virulent strain PRV AH China 2013 strains were virulence genes gE and gI partial deletion of gI/gE gene deletion strains of the pseudorabies virus epidemic. The present invention isolates gI/gE gene deletion in the mutant of pseudorabies virus PRV AH gI

【技术实现步骤摘要】
伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用
本专利技术属于动物病毒学及基因工程学
，具体涉及一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用。
技术介绍
伪狂犬病(PseudorabiesVirus，PRV)是由伪狂犬病毒引起的多种家畜和野生动物均可感染的一种急性传染病。在自然条件下，本病最常见于猪及其他易感动物，对猪主要表现为神经症状、繁殖障碍、生长停滞及高死亡率。哺乳仔猪感染后主要临床表现为神经症状，死亡率几乎高达100％；一般情况下成猪感染不发病，多呈隐形经过；妊娠母猪感染后可引起流产、死胎和木乃伊胎。免疫接种是防控PRV的最有效方法。为了控制PRV，我国猪场自上世纪末开始广泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRVBartha-K61株活疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪流产、产死胎、木乃伊胎的情况，仔猪出现神经症状及死亡等临床症状，且从部分猪场已分离出变异毒株。这表明，目前使用的商品化疫苗对变异株的保护效果不佳，导致了我国猪场伪狂犬发病率的抬头趋势。因此，为了有效控制PRV变异株的流行，需要开发更为高效的针对PRV变异株的疫苗。
技术实现思路
为了克服现有技术中猪伪狂犬病毒疫苗不能完全抵抗强毒变异株感染等不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株。本专利技术的另一目的在于提供上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的构建方法。本专利技术的再一目的在于提供上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的应用。本专利技术的第四个目的在于提供一种猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，该灭活疫苗由上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株制备得到。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株，为将伪狂犬病毒变异株的gI基因的后半部分、gI和gE之间的连接序列以及gE基因的前半部共计三部分敲除后得到；所述突变株的gI/gE基因的核苷酸序列为：5’-GACGGCTCCGCGGGCTCCTCCTCGCCGCCCTGACCCTGGCCGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCCTCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTCGCCGGCAGCGCCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAACCTGACGATAGACGGGACGCTGCTGAATCGTCGACCTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCCGCCCCGCTTAAATACCGGGAGAACCGGTCCGCCCGCATTCCGACATGCCCGGCGCCGCCTCCGTCGACATGGAACGGTTTGACCT-3’所述的伪狂犬病毒变异株优选为伪狂犬病毒变异株PRVAH-China-2013株；所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的构建方法，包含如下步骤：(1)根据PRVZJ01株基因序列(登录号：KM061380.1)，以伪狂犬病毒变异株PRVAH-China-2013株为模板，设计2对引物，LA-F/LA-R与RA-F/RA-R，分别扩增位于gI基因和gE基因两侧(含部分gI和gE基因)的可用于同源重组的左臂片段LA和右臂片段RA；其中，LA包括部分gD基因和部分gI基因，RA包括部分gE基因、全部的US9基因和部分US2基因；(2)将步骤(1)扩增得到的LA片段与pMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD-LA；将重组质粒pMD-LA与步骤(1)扩增得到的RA片段分别用限制性内切酶HindШ和PstI进行双酶切，将酶切后的pMD-LA与酶切后的RA片段进行连接，得到重组质粒pMD-LA-RA；(3)以质粒pEGFP-N1为模板，设计引物EGFP-F1和EGFP-R1，扩增得到EGFP完整表达盒；(4)将步骤(2)制得的重组质粒pMD-LA-RA和步骤(3)扩增得到的EGFP完整表达盒分别用限制性内切酶EcoRV进行单酶切，对酶切后的pMD-LA-RA进行去磷酸化处理，将去磷酸化后的pMD-LA-RA与酶切后的EGFP完整表达盒连接，得到重组质粒pMD-LA-EGFP-RA；(5)将步骤(4)制得的重组质粒pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞，然后再以伪狂犬病毒变异株PRVAH-China-2013株感染已转染的BHK-21细胞，使重组质粒pMD-LA-EGFP-RA与PRVAH-China-2013株基因组在细胞内发生同源重组，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒PRVAHgI-/gE-/EGFP+；(6)将步骤(2)制得的重组质粒pMD-LA-RA转染BHK-21细胞，然后再以步骤(5)制得的重组病毒PRVAHgI-/gE-/EGFP+感染已转染的BHK-21细胞，使重组质粒pMD-LA-RA与PRVAHgI-/gE-/EGFP+基因组在细胞内发生同源重组，以EGFP为筛选标记，通过空斑纯化筛选不出现绿色荧光的空斑即可获得重组病毒PRVAHgI-/gE-，此即为伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株；其中，引物LA-F、LA-R、RA-F、RA-R、EGFP-F1和EGFP-R1序列如下所示：LA-F：5’-CCGACCAGCACCGCACGTACAAGTT-3’；LA-R：5’-CAGCAGCGTCCCGTCTATCGT-3’；RA-F：5’-AAACTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGG-3’；RA-R：5’-CTCGGTGGTGATGTAGAAAAGCTTGGG-3’；EGFP-F1：5’-AACGATATCGTTTAAACGTTCTTTCCTGCGTTATCC-3’；EGFP-R1：5’-AACGATATCAACCCTATCTCGGTCTATTCT-3’；所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株在制备伪狂犬病毒灭活疫苗中的应用；一种猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，包含上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株；所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗，优选包含上述伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株、佐剂和灭活剂；所述的灭活剂优选为β-丙内酯；所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的TCID50优选为10-7.25/100μL，灭活剂与伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的体积比优选为1:2000；所述的佐剂优选为Montanidegel佐剂；所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株与灭活剂混合灭活后，将灭活后的病毒液进行稀释，稀释后的病毒液与Montanidegel佐剂的体积比优选为9:1，病毒最终含量优选为106.0TCID50～107.0TCID50/mL；所述的猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗的制备方法，包含如下步骤：(1)以1MOI的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株(PRVAHgI-/gE-)感染BHK-21细胞，当细胞病变达90％时收获病毒，反复冻融3次，收集病毒液，12000r/min离心10min，取上清，以除去细胞碎片，测定病毒液的TCID50为10-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株，其特征在于：为将伪狂犬病毒变异株的gI基因的后半部分、gI和gE之间的连接序列以及gE基因的前半部共计三部分敲除后得到；所述突变株的gI/gE基因的核苷酸序列为：5’‑GACGGCTCCGCGGGCTCCTCCTCGCCGCCCTGACCCTGGCCGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCCTCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTCGCCGGCAGCGCCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAACCTGACGATAGACGGGACGCTGCTGAATCGTCGACCTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCCGCCCCGCTTAAATACCGGGAGAACCGGTCCGCCCGCATTCCGACATGCCCGGCGCCGCCTCCGTCGACATGGAACGGTTTGACCT‑3’；所述的伪狂犬病毒变异株为伪狂犬病毒变异株PRV AH‑China‑2013株。

【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株，其特征在于：为将伪狂犬病毒变异株的gI基因的后半部分、gI和gE之间的连接序列以及gE基因的前半部共计三部分敲除后得到；所述突变株的gI/gE基因的核苷酸序列为：5’-GACGGCTCCGCGGGCTCCTCCTCGCCGCCCTGACCCTGGCCGCCCTGACCCCGCGCGTCGGGGGCGTCCTCTTCAGGGGCGCCGGCGTCAGCGTGCACGTCGCCGGCAGCGCCGTCCTCGTGCCCGGCGACGCGCCCAACCTGACGATAGACGGGACGCTGCTGAATCGTCGACCTGCAGGATATCCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCCGCCCCGCTTAAATACCGGGAGAACCGGTCCGCCCGCATTCCGACATGCCCGGCGCCGCCTCCGTCGACATGGAACGGTTTGACCT-3’；所述的伪狂犬病毒变异株为伪狂犬病毒变异株PRVAH-China-2013株。2.权利要求1所述的伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的构建方法，其特征在于包含如下步骤：(1)根据PRVZJ01株基因序列，以伪狂犬病毒变异株PRVAH-China-2013株为模板，设计2对引物，LA-F/LA-R与RA-F/RA-R，分别扩增位于gI基因和gE基因两侧的可用于同源重组的左臂片段LA和右臂片段RA；其中，LA包括部分gD基因和部分gI基因，RA包括部分gE基因、全部的US9基因和部分US2基因；(2)将步骤(1)扩增得到的LA片段与pMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD-LA；将重组质粒pMD-LA与步骤(1)扩增得到的RA片段分别用限制性内切酶HindШ和PstI进行双酶切，将酶切后的pMD-LA与酶切后的RA片段进行连接，得到重组质粒pMD-LA-RA；(3)以质粒pEGFP-N1为模板，设计引物EGFP-F1和EGFP-R1，扩增得到EGFP完整表达盒；(4)将步骤(2)制得的重组质粒pMD-LA-RA和步骤(3)扩增得到的EGFP完整表达盒分别用限制性内切酶EcoRV进行单酶切，对酶切后的pMD-LA-RA进行去磷酸化处理，将去磷酸化后的pMD-LA-RA与酶切后的EGFP完整表达盒连接，得到重组质粒pMD-LA-EGFP-RA；(5)将步骤(4)制得的重组质粒pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞，然后再以伪狂犬病毒变异株PRVAH-China-2013株感染已转染的BHK-21细胞，使重组质粒pMD-LA-EGFP-RA与PRVAH-China-2013株基因组在细胞内发生同源重组，以EGFP为筛选标记，通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：琚春梅，李艳华，向柯宇，潘慧，唐栋，程珍珠，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44