赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法技术

本发明专利技术属于生化分析领域，涉及一种赖氨酸氮连接的磷酸化翻译后修饰富集和鉴定方法。利用赖氨酸氮连接磷酸化肽上磷酸基团丢失前、后在色谱分离上的保留差异，采用色谱法对赖氨酸磷酸化肽实现特异性富集，进而通过质谱分析获得鉴定。通过该方法，实现赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰位点的大规模富集和鉴定。

The method of post translation enrichment and identification by phosphorylation of lysine

The present invention belongs to the field of biochemical analysis, and relates to a method of phosphorylation post - translation enrichment and identification of lysine - nitrogen connection. The retention differences of phosphate groups before and after the loss of phosphate groups were analyzed by lysine nitrogen connection. The lysine phosphorylated peptides were specifically enriched by chromatography, and then identified by mass spectrometry. Through this method, a large-scale enrichment and identification of the post translational modification site of the lysine nitrogen connection was realized.

【技术实现步骤摘要】
赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法
本专利技术涉及生化分析领域，具体的说，是一种通过化学标记和色谱分级技术，实现赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰的富集和鉴定。
技术介绍
蛋白的磷酸化修饰是生物体内最常见、最重要的一种翻译后修饰，对蛋白质的结构和功能起到了重要的调节作用。近些年来，在大规模的磷酸化翻译后修饰的研究中，高效的磷酸化蛋白/磷酸化肽富集技术结合多维色谱分离技术以及高分辨的质谱的应用，极大的增强了磷酸化翻译后修饰的动态范围和检测限，越来越多的磷酸化位点和磷酸化蛋白能够被检测。然而，这些磷酸化翻译后修饰位点的主要集中于氧连接的磷酸化氨基酸(如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)，对于氮连接的磷酸化翻译后修饰和生物学功能研究却鲜有报道。由于赖氨酸氮连接磷酸化不同于其他氧连接磷酸化氨基酸的化学性质，在酸性条件下极不稳定，其在传统的研究方法中容易发生水解去磷酸化，因此尚无针对赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的文献报道。仅有少数文献研究了赖氨酸氮连接磷酸化肽的合成方法(JordiBertran-Vicente,JournaloftheAmericanChemicalSociety,2014,136,13622-13628)及其在质谱中的碎裂规则(JordiBertran-Vicente,AnalyticalChemistry,2015,6990-6994)。随着现代生物化学与分子生物学技术的不断进步，人们对氮连接磷酸化翻译后的结构和功能的进一步认识，本领域也因此开始迅速发展。基于此，我们提出了一种通过化学标记和色谱分级技术，实现了赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰的富集和大规模鉴定。
技术实现思路
本专利技术利用赖氨酸氮连接磷酸化肽上磷酸基团丢失前、后在色谱分离上的保留差异，采用色谱法对赖氨酸磷酸化肽实现特异性富集，进而通过质谱分析获得鉴定。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案步骤如下：一种赖氨酸氮连接的磷酸化翻译后修饰肽段的富集和鉴定方法：步骤1)首先对蛋白酶解产物中的赖氨酸进行第一次化学标记；步骤2)然后对第一次化学标记的蛋白酶解产物进行第一次色谱分级，按照色谱保留时间，等时间间隔(0.5-30min)或不等时间间隔(0.5-30min)分别收集N个级分(N为大于或等于2的正整数)；步骤3)对于步骤(2)中第一次色谱分级的N个级分分别进行去除赖氨酸上磷酸基团的操作；步骤4)对步骤(3)中除去磷酸基团的N个级分分别进行第二次色谱分级，并收集与步骤(2)中具有保留差异的组分；步骤5)对步骤(4)中收集组分的赖氨酸进行第二次化学标记(与第一次的标记基团不同)，最后对其进行质谱鉴定。蛋白酶解产物是胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶以及蛋白内切酶中的一种或二种以上对蛋白进行酶解后的产物。第一次化学标记是能与肽段N端和赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性反应同时生成化学标签的试剂，该试剂包括酸酐类试剂，如0.01-100％(w/w)的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐；羧基活化类试剂，如0.01-100％(w/w)的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶；醛类试剂，如0.01-100％(w/w)的甲醛、乙醛、丙醛；以及氨基酸类试剂，如0.01-1M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸，反应的缓冲体系为：10-500mM的磷酸缓冲液(pH7-9)、10-500mM的碳酸氢铵缓冲液(pH7-9)、10-500mM的Tris-HCl缓冲液(pH6-10)中的一种或多种。第二次化学标记是能与肽段N端和赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性反应同时生成化学标签的试剂，该试剂包括酸酐类试剂，如0.01-100％(w/w)的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐；羧基活化类试剂，如0.01-100％(w/w)的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶；醛类试剂，如0.01-100％(w/w)的甲醛、乙醛、丙醛；以及氨基酸类试剂，如0.01-1M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸。反应的缓冲体系为：10-500mM的磷酸缓冲液(pH7-9)、10-500mM的碳酸氢铵缓冲液(pH7-9)、10-500mM的Tris-HCl缓冲液(pH6-10)中的一种或多种；第一次化学标记和第二次化学标记所产生的标记集团的分子量不相同。操作过程中，步骤(2)中的第一次色谱分级与步骤(4)中的第二次色谱分级的分级方法与操作条件保持一致；色谱分级包括反相色谱分级、亲水色谱分级、强阳离子交换色谱分级、强阴离子交换色谱分级、等电聚焦色谱分级、尺寸排阻色谱分级方法中的一种或两种。去除赖氨酸上磷酸基团的操作运用磷酸酶去除法和酸去除法中的一种或两种；所述磷酸酶去除法是采用一种或两种赖氨酸磷酸酶去除赖氨酸上的磷酸基团的方法，磷酸酶包括碱性赖氨酸磷酸酶或酸性赖氨酸磷酸酶中的一种或两种；所述酸去除法是采用酸性物质去除赖氨酸上的磷酸基团的方法，酸性物质是1.0≤pH≤4.0的液体物质。所述的保留差异是指在两次色谱分级中(步骤(2)和步骤(4))，第一次色谱分级的每一个级分在第二次色谱分级中的保留时间出现偏差且偏差大于或等于2min的组分。所述质谱是飞行时间类质谱、离子阱类和轨道阱类质谱中的一种或二种。本专利技术所述方法应用于蛋白质组学分析。所述的蛋白酶解、第一次化学标记、色谱分级、除去磷酸基团、第一次化学标记和保留差异详细说明如下：(1)蛋白酶解：将蛋白进行变性还原烷基化后，利用蛋白酶，如胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和蛋白内切酶，37℃条件下对蛋白进行酶解1-24h；所述蛋白为标准蛋白或标准蛋白混合物、细胞或组织中提取的全蛋白或部分蛋白。(2)第一次化学标记：用一种标记试剂对肽段N端和赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性标记，其中标记试剂为：酸酐类试剂，如0.01-100％(w/w)的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐；羧基活化类试剂，如0.01-100％(w/w)的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶；醛类试剂，如0.01-100％(w/w)的甲醛、乙醛、丙醛；以及氨基酸类试剂，如0.01-1M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸。反应的缓冲体系为：10-500mM的磷酸缓冲液(pH7-9)、10-500mM的碳酸氢铵缓冲液(pH7-9)、10-500mM的Tris-HCl缓冲液(pH6-10)中的一种或多种。(3)色谱分级：利用反相色谱分级、亲水色谱分级、强阳离子交换色谱分级、强阴离子交换色谱分级、等电聚焦色谱分级、尺寸排阻色谱分级方法中的一种或两种对肽段进行分级，同时收集不同保留时间的馏出组分。步骤(2)和步骤(4)的两次色谱分级方法一致。(4)除去磷酸基团：在合适的条件下(pH2-12)，加入一定量磷酸酶(如碱性赖氨酸磷酸酶或酸性赖氨酸磷酸酶)，在一定温度(4-50℃)下孵育0.01-24h；或加入酸性物质(如甲酸、乙酸、三氟乙酸、盐酸等pH大于或等于1.0，小于或等于4.0的液体)，在一定温度(1-100℃)下孵育0.01-24h。(5)第二次化学标记：用一种标记试剂对肽段N端和赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性标记。其中标记试剂为：酸酐类试剂，如0.01-100％(w/w)的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐；羧基活化类试剂，如0.01-100％(w/w)的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶；醛类试剂，如0.01-100％(w/w)的甲醛、乙醛、丙醛；以及氨基酸类试剂，如0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种赖氨酸氮连接的磷酸化翻译后修饰肽段的富集和鉴定方法，其特征在于：步骤1)首先对蛋白酶解产物中的赖氨酸进行第一次化学标记；步骤2)然后对第一次化学标记的蛋白酶解产物进行第一次色谱分级，按照色谱保留时间，等时间间隔或不等时间间隔分别收集N个级分,N为大于或等于2的正整数；步骤3)对于步骤(2)中第一次色谱分级的N个级分分别进行去除赖氨酸上磷酸基团的操作；步骤4)对步骤(3)中除去磷酸基团的N个级分分别进行第二次色谱分级，并收集与步骤(2)中具有保留差异的组分；步骤5)对步骤(4)中收集组分的赖氨酸进行第二次化学标记(与第一次的标记基团不同)，最后对其进行质谱鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种赖氨酸氮连接的磷酸化翻译后修饰肽段的富集和鉴定方法，其特征在于：步骤1)首先对蛋白酶解产物中的赖氨酸进行第一次化学标记；步骤2)然后对第一次化学标记的蛋白酶解产物进行第一次色谱分级，按照色谱保留时间，等时间间隔或不等时间间隔分别收集N个级分,N为大于或等于2的正整数；步骤3)对于步骤(2)中第一次色谱分级的N个级分分别进行去除赖氨酸上磷酸基团的操作；步骤4)对步骤(3)中除去磷酸基团的N个级分分别进行第二次色谱分级，并收集与步骤(2)中具有保留差异的组分；步骤5)对步骤(4)中收集组分的赖氨酸进行第二次化学标记(与第一次的标记基团不同)，最后对其进行质谱鉴定。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：蛋白酶解产物是胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶以及蛋白内切酶中的一种或二种以上对蛋白进行酶解后的产物。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：第一次化学标记是能与肽段N端和赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性反应同时生成化学标签的试剂，该试剂包括酸酐类试剂，如0.01-100％(w/w)的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐；羧基活化类试剂，如0.01-100％(w/w)的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶；醛类试剂，如0.01-100％(w/w)的甲醛、乙醛、丙醛；以及氨基酸类试剂，如0.01-1M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸，反应的缓冲体系为：10-500mM的磷酸缓冲液(pH7-9)、10-500mM的碳酸氢铵缓冲液(pH7-9)、10-500mM的Tris-HCl缓冲液(pH6-10)中的一种或多种。第二次化学标记是能与肽段N端和赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性反应同时生成化学标签的试剂，该试剂包括酸酐类试剂，如0.01-100％(w/w)的乙酸酐、丙酸酐、丁二...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，翁叶靖，胡晔晨，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21