一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法技术

本发明专利技术涉及文物检测领域，公开了一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法，先以红薯为碳源制备了荧光碳点，然后用荧光碳点标记桑蚕丝和柞蚕丝蚕丝的二抗，之后逐步采用离子液体和PM13‑碱性蛋白酶对混淆的古代丝织品文物样进行水解，得到蛋白提取液后，经透析、纯化，进行SDS‑PAGE凝胶电泳，将得到的蛋白条带转移到PVDF膜上，经蚕丝一抗和荧光碳点标记的二抗孵育后，可在凝胶成像系统中观察到免疫荧光条带，鉴别古代丝织品的种类。本发明专利技术中化学试剂用量少，反应温和、环保无害；在对古代丝织品进行检测时，具有样品用量少、直观、快速和高灵敏性的特点。

A method based on immune trace method to identify the species of silkworm silk in ancient silk fabrics

The present invention relates to cultural relics detection field, and discloses a method for identifying traces of ancient silk silk pieces immune species based on, first to the sweet potato as fluorescent carbon dots prepared carbon source system, and then use the fluorescent carbon dots mark silk silk two anti, after gradually using ionic liquid and PM13 alkaline protease to confuse the ancient silk cultural relics were obtained after hydrolysis, protein extraction, dialysis, purification, SDS PAGE gel electrophoresis, the protein bands were transferred to PVDF membrane, a silk and anti fluorescent carbon dots two resistance after incubation to immunofluorescence observed in gel the imaging system, identification of ancient Silk fabrics. The invention has the advantages of less chemical reagents, mild reaction, environmental protection and harmlessness. When testing ancient silk fabrics, it has the characteristics of less sample consumption, intuitionistic, fast and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法
本专利技术涉及文物检测领域，尤其涉及一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法。
技术介绍
几千年来，丝绸一直是古老中国的象征，而悠久灿烂的中华文化通过丝绸之路走向世界。蚕丝是天然蛋白质纤维，是由氨基酸通过肽键作用连接而成的天然高分子材料。常用的蚕丝包括桑蚕丝、柞蚕丝和蓖麻蚕丝等，因其氨基酸含量和分子间的微观结构不同，其纺织品具有不同的力学性质和服用性能。在古代丝绸遗存中，从历年来的考古发掘可以看出，丝绸遗存表现形式主要分为四个类型：丝织品实物、灰化丝织品、矿化丝织品和泥化丝织品。尤其是墓葬中出土的衣物，由于经过温度、湿度、土壤的酸碱性、细菌、霉菌、体液和尸腐物的侵蚀，从而变硬脆，甚至矿化、降解，不同种蚕丝的丝织物已经无法辨识，且年代越早的证据越难寻觅，给丝绸文物的鉴定和保护研究带来了很大的困难。因此如何利用现代先进的自然科学手段，从古代丝织品中提取有效信息，对确定丝绸的起源有重要的价值。在现阶段的研究中，国内外对古代丝织品的研究手段大多还是采用红外光谱、拉曼光谱、X射线衍射等技术，这些技术灵敏度低，受杂质影响较大，不适合对微量文物样品进行检测如何寻找一种更为科学的手段来鉴定古代丝织品一直是文物保护界的难题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法。利用本专利技术方法对古代丝织品残片进行鉴别时，具有直观、准确、高灵敏性的特点。本专利技术的具体技术方案为：一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法，采用如下步骤：1）荧光碳点的制备：将红薯碎块和KH2PO4浸入蒸馏水中，于水热反应釜内反应，取出反应液，经超声、抽滤、透析得到荧光碳点溶液，之后经冷冻干燥，得到荧光碳点粉末。2）荧光碳点标记蚕丝丝素蛋白二抗的制备：将荧光碳点分散在PBS缓冲液中，加入碳化二亚胺后，分别加入桑蚕丝和柞蚕丝丝素蛋白二抗，制得荧光碳点标记桑蚕丝二抗和荧光碳点标记柞蚕丝二抗。3）分别称取等质量已被混淆的由桑蚕丝、柞蚕丝和蓖麻蚕丝制作的古代纺织品残片作为样品，小心用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干，分别标记为A，B，C三组。4）将A，B，C三组样品以1:95-105的浴比在含有0.4-0.6wt%Na2PO4和0.2-1.2wt%C17H35COONa的混合溶液中煮沸25-35min，进行脱胶处理，共脱胶两次；脱胶之后，样品用去离子水小心搓洗4次以上，放入烘箱干燥。5）将A，B，C三组古代丝织品残片以1:45-55的浴比浸入[AMIM]Cl离子液体中，加热反应，冷却；加入PM13-碱性蛋白酶粉末恒温孵育5-7h，进行灭酶，得到三组丝素蛋白/离子液体溶液A、B、C。6）待丝素蛋白/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，使丝素蛋白析出，对混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，分别得到丝素蛋白提取液A、B、C；将三组丝素蛋白提取液在1-5℃条件下用透析袋透析10-14h，除去小分子杂质；对透析后的丝素蛋白提取液进行真空浓缩，在2500-3500rpm、温度8-12℃条件下浓缩至终体积约为200μL，得到丝素蛋白浓缩液A、B、C。7）SDS-PAGE凝胶电泳：分别量取45-55μL丝素蛋白浓缩液A、B、C，用CB9.6缓冲液稀释至4.5-5.5mL，在98-102℃条件下加热4-6min，进行变性处理；冷却后至室温后，将三种样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶（上层为浓缩胶，下层为分离胶）加样孔中，在电解槽中加满电解液，电泳完成后，在成像系统中观察电泳图像；本实验中一次制作两张样品胶，记为胶1、胶2。使用免染胶进行凝胶电泳，可减少化学试剂的使用，同时节约时间。8）电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的PVDF膜上，夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层，放入湿式转膜装置中，恒流转膜。可得到两张电转移膜，记为膜1、膜2。使用的PVDF膜先用甲醇浸泡，目的是活化PVDF膜上面的正点集团，使它更容易与带负电的蛋白质结合。9）膜成像：电转移完成后，取出PVDF膜，放入凝胶成像系统中成像，观察蛋白条带转移情况。对膜进行成像，观察蛋白条带的转移情况，方便掌握实验进度，优化实验步骤。10）封闭：取出PVDF膜，用14-16mL的TBS液洗膜4-6min，用封闭液在室温条件下处理50-70min。11）免疫处理：用抗体稀释液以950-1050:1的体积比稀释桑蚕丝一抗，将膜1浸没在一抗稀释液中，室温条件下摇床孵育1~2h；取出膜1后用TBST液洗膜，之后浸入8-12mL稀释的荧光碳点标记的桑蚕丝二抗液中室温条件下孵育1-25h；膜2用柞蚕丝抗体进行同样处理。12）发光显色：直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像，利用荧光碳点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像；膜1中得到荧光条带为桑蚕丝纺织品残片，膜2中得到荧光条带的为柞蚕丝纺织品残片，则另一样品即为蓖麻蚕丝纺织品残片。作为优选，步骤1）中，所述荧光碳点的制备方法具体为：称取1.8-2.2g红薯块茎碎块和5.5-6.5gKH2PO4，加入8-12mL蒸馏水，将混合溶液倒入水热反应釜中密封，置于180~220℃烘箱中加热10~15h，冷却至室温后，取出反应液，超声10min，用0.22μm微孔膜抽滤，得到浅黄色的荧光碳点液体；将得到的溶液用截留分子量1000的透析袋透析20-28h以除去其他小分子杂质；最后对纯化的碳点溶液进行冷冻干燥，可得到荧光碳点粉末。荧光碳点表面具有很多缺陷能带，当受到激发光照射时，由于其电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后激子会发生辐射重组而发射荧光。作为优选，步骤2）中，荧光碳点标记桑蚕丝二抗和荧光碳点标记柞蚕丝二抗的制备方法具体如下：将荧光碳点、碳化二亚胺和二抗加入到8-12mmol/L的PBS缓冲液中，在室温条件下搅拌2~3h后，用PBS缓冲液对溶液进行多次洗涤离心，即可得到荧光碳点标记的桑蚕丝素蛋白二抗和柞蚕丝素蛋白二抗。荧光碳点经过偶联后，其荧光能力增强。荧光碳点表面含有丰富的基团如羧基、羟基、氨基等，他们在一定程度上可以捕获辐射荧光的激子，因此经偶联后荧光能力增强，同时也可以避免荧光碳点粒子团聚现象。作为优选，步骤5）中，所述PM13-碱性蛋白酶的制备：向95-105mL的0.1M的硼酸钠缓冲溶液中加入0.10-0.20g碱性蛋白酶和3.5-4.0g的MW15000的梳状PEG，在1-5℃条件下缓慢搅拌0.5-1.5h，在外加45-55mL1mmol/LHCl的条件下超滤除去未反应的PM13，重复三次，将滤液进行冷冻干燥，得到PM13-碱性蛋白酶粉末。本专利技术先使用离子液体对样品进行初步溶解，再使用PM13-碱性蛋白酶对丝素进行进一步溶解。离子液体是近年来兴起的一类极具应用前景的绿色溶剂，是一种强极性溶剂，可与丝素蛋白大分子上的氨基和羧基形成氢键，从而破坏丝素蛋白分子内部的氢键，从而实现对蛋白质的溶解。生物酶是一种无毒无害、与环境友好的催化剂，拥有高效的特异性；且用量少，减少污染，节约资源；水解条件（温度、pH）温和，对氨基酸破坏小，同时，经本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法，其特征在于采用如下步骤：1）荧光碳点的制备：将红薯碎块和KH2PO4浸入蒸馏水中，于水热反应釜内反应，取出反应液，经超声、抽滤、透析得到荧光碳点溶液，之后经冷冻干燥，得到荧光碳点粉末；2）荧光碳点标记蚕丝丝素蛋白二抗的制备：将荧光碳点分散在PBS缓冲液中，加入碳化二亚胺后，分别加入桑蚕丝和柞蚕丝丝素蛋白二抗，制得荧光碳点标记桑蚕丝二抗和荧光碳点标记柞蚕丝二抗；3）分别称取等质量已被混淆的由桑蚕丝、柞蚕丝和蓖麻蚕丝制作的古代纺织品残片作为样品，小心用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干，分别标记为A，B，C三组；4）将A，B，C三组样品以1:95‑105的浴比在含有0.4‑0.6wt% Na2PO4和0.2‑1.2wt%C17H35COONa的混合溶液中煮沸25‑35min，进行脱胶处理，共脱胶两次；脱胶之后，样品用去离子水小心搓洗4次以上，放入烘箱干燥；5） 将A，B，C三组古代丝织品残片以1:45‑55的浴比浸入[AMIM]Cl离子液体中，加热反应，冷却；加入PM13‑碱性蛋白酶粉末恒温孵育5‑7h，进行灭酶，得到三组丝素蛋白/离子液体溶液A、B、C；6）待丝素蛋白/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，使丝素蛋白析出，对混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，分别得到丝素蛋白提取液A、B、C；将三组丝素蛋白提取液在1‑5℃条件下用透析袋透析10‑14 h，除去小分子杂质；对透析后的丝素蛋白提取液进行真空浓缩，在2500‑3500rpm、温度8‑12℃条件下浓缩至终体积约为200μL，得到丝素蛋白浓缩液A、B、C；7）SDS‑PAGE凝胶电泳：分别量取45‑55μL丝素蛋白浓缩液A、B、C，用CB 9.6缓冲液稀释至4.5‑5.5mL，在98‑102℃条件下加热4‑6min，进行变性处理；冷却后至室温后，将三种样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶加样孔中，在电解槽中加满电解液，电泳完成后，在成像系统中观察电泳图像；本实验中一次制作两张样品胶，记为胶1、胶2；8）电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的PVDF膜上，夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层，放入湿式转膜装置中，恒流转膜；可得到两张电转移膜，记为膜1、膜2；9）膜成像：电转移完成后，取出PVDF膜，放入凝胶成像系统中成像，观察蛋白条带转移情况；10）封闭：取出PVDF膜，用14‑16mL的TBS液洗膜4‑6min，用封闭液在室温条件下处理50‑70min；11）免疫处理：用抗体稀释液以950‑1050:1的体积比稀释桑蚕丝一抗，将膜1浸没在一抗稀释液中，室温条件下摇床孵育1~2 h；取出膜1后用TBST液洗膜，之后浸入8‑12mL稀释的荧光碳点标记的桑蚕丝二抗液中室温条件下孵育1‑25 h；膜2用柞蚕丝抗体进行同样处理；12）发光显色：直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像，利用荧光碳点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像；膜1中得到荧光条带为桑蚕丝纺织品残片，膜2中得到荧光条带的为柞蚕丝纺织品残片，则另一样品即为蓖麻蚕丝纺织品残片。...

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法，其特征在于采用如下步骤：1）荧光碳点的制备：将红薯碎块和KH2PO4浸入蒸馏水中，于水热反应釜内反应，取出反应液，经超声、抽滤、透析得到荧光碳点溶液，之后经冷冻干燥，得到荧光碳点粉末；2）荧光碳点标记蚕丝丝素蛋白二抗的制备：将荧光碳点分散在PBS缓冲液中，加入碳化二亚胺后，分别加入桑蚕丝和柞蚕丝丝素蛋白二抗，制得荧光碳点标记桑蚕丝二抗和荧光碳点标记柞蚕丝二抗；3）分别称取等质量已被混淆的由桑蚕丝、柞蚕丝和蓖麻蚕丝制作的古代纺织品残片作为样品，小心用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干，分别标记为A，B，C三组；4）将A，B，C三组样品以1:95-105的浴比在含有0.4-0.6wt%Na2PO4和0.2-1.2wt%C17H35COONa的混合溶液中煮沸25-35min，进行脱胶处理，共脱胶两次；脱胶之后，样品用去离子水小心搓洗4次以上，放入烘箱干燥；5）将A，B，C三组古代丝织品残片以1:45-55的浴比浸入[AMIM]Cl离子液体中，加热反应，冷却；加入PM13-碱性蛋白酶粉末恒温孵育5-7h，进行灭酶，得到三组丝素蛋白/离子液体溶液A、B、C；6）待丝素蛋白/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，使丝素蛋白析出，对混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，分别得到丝素蛋白提取液A、B、C；将三组丝素蛋白提取液在1-5℃条件下用透析袋透析10-14h，除去小分子杂质；对透析后的丝素蛋白提取液进行真空浓缩，在2500-3500rpm、温度8-12℃条件下浓缩至终体积约为200μL，得到丝素蛋白浓缩液A、B、C；7）SDS-PAGE凝胶电泳：分别量取45-55μL丝素蛋白浓缩液A、B、C，用CB9.6缓冲液稀释至4.5-5.5mL，在98-102℃条件下加热4-6min，进行变性处理；冷却后至室温后，将三种样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶加样孔中，在电解槽中加满电解液，电泳完成后，在成像系统中观察电泳图像；本实验中一次制作两张样品胶，记为胶1、胶2；8）电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的PVDF膜上，夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层，放入湿式转膜装置中，恒流转膜；可得到两张电转移膜，记为膜1、膜2；9）膜成像：电转移完成后，取出PVDF膜，放入凝胶成像系统中成像，观察蛋白条带转移情况；10）封闭：取出PVDF膜，用14-16mL的TBS液洗膜4-6min，用封闭液在室温条件下处理50-70min；11）免疫处理：用抗体稀释液以950-1050:1的体积比稀释桑蚕丝一抗，将膜1浸没在一抗稀释液中，室温条件下摇床孵育1~2h；取出膜1后用TBST液洗膜，之后浸入8-12mL稀释的荧光碳点标记的桑蚕丝二抗液中室温条件下孵育1-25h；膜2用柞蚕丝抗体进行同样处理；12）发光显色：直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像，利用荧光碳点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像；膜1中得到荧光条带为...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡智文，陈茹茹，李津，梁军龙，郑浩然，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33