一种降低抗PD‑L1抗体中蛋白聚合物的细胞培养方法技术

本发明专利技术属于细胞培养领域，提供了一种降低抗PD‑L1抗体中蛋白聚合物的细胞培养方法，包括在允许抗PD‑L1抗体产生的细胞培养条件下，补料添加赖氨酸、精氨酸及氯化钙，使抗体聚合物含量显著降低了28.5％，减小了后续纯化抗PD‑L1抗体的压力，同时该方法操作简便，容易实施，有效提高了抗体的质量。

A method for culture of reduced protein polymer anti PD L1 antibody in cells

The invention belongs to the field of cell culture, culture provides a method of reducing protein polymer anti PD L1 antibody in cells, including the culture conditions in allowing the L1 antibody against PD cells, fed added lysine, arginine and calcium chloride, the antibody polymer content significantly decreased by 28.5%. Reduces the subsequent purification of L1 antibody against PD pressure, at the same time, the method is simple, easy to implement, can effectively improve the quality of the antibody.

【技术实现步骤摘要】
一种降低抗PD-L1抗体中蛋白聚合物的细胞培养方法
本专利技术涉及细胞培养领域。更具体的，本专利技术涉及一种通过优化细胞培养条件，降低表达的抗PD-L1抗体中蛋白聚合物的方法。
技术介绍
PD-L1(Programmeddeath-ligand1)又称为CD247和B7-H1，是程序性死亡分子1(programmeddeath-1，PD-1)的一个配体。PD-L1在多种肿瘤细胞表面高表达，而且肿瘤的恶性程度以及不良预后与PD-L1的表达水平密切相关。在肿瘤微环境中，癌症细胞表面的PD-L1通过与T细胞表面的PD-1或CD80的结合，抑制T细胞的激活和增殖，促进效应T细胞进入衰竭或无反应状态，诱导T细胞的凋亡，刺激辅助T细胞分化成为调节性T细胞，从而阻止T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。PD-L1抗体可以通过阻断PD-L1与PD-1及CD80的相互作用，使得相关的负调控信号不能被启动与传导，从而避免了在肿瘤微环境中的效应T细胞的活性被抑制，使T细胞可以发挥杀伤和抑制肿瘤细胞的功能。由于PD-L1抗体能够直接作用于肿瘤组织，因而具有较高的特异性和安全性。目前国际上主要的PD-L1单抗药物产品包括罗氏的Atezolizumab和阿斯利康的Durvalumab，处于临床晚期研究阶段，国内尚无PD-L1单抗药物获批生产。WO2016022630公开了一类新的抗PD-L1抗体，对PD-L1具有较高的亲和力，能够显著抑制细胞表面的PD-L1和PD-1的相互作用，并显著促进T细胞分泌IL-2和IFN-γ。大规模的培养经过基因改造的宿主细胞已被广泛应用于生产如单克隆抗体、免疫调节因子以及各种基因重组蛋白质类药物。但在细胞培养过程中蛋白的聚集现象被广泛报道，事实上，对于在哺乳动物细胞培养表达的某些单克隆抗体聚集水平高达到30％(KramarczykJF,et.al.2008.High-throughputscreeningofchromatographicseparations:II.Hydrophobicinteraction.BiotechnolBioeng100(4):707–720)。在细胞培养过程中蛋白聚集可能形成在(i)细胞内蛋白表达时以及(ii)蛋白表达后分泌到细胞培养基时。在表达过程中，由于未折叠蛋白分子的相互作用或通过负责正确折叠的分子伴侣对新生多肽链的无效识别，导致在胞内积累的大量蛋白聚集(ZhangYB,et.al2004.Proteinaggregationduringoverexpressionlimitedbypeptideextensionswithlargenetnegativecharge.ProteinExprPurif36(2):207–216)。蛋白表达后分泌到培养基后，分泌蛋白可能暴露于不利于蛋白稳定性的条件，这可能也是蛋白聚集产生的原因。蛋白聚合物的存在会大大增加抗体的免疫原性，从而对抗体的安全性和有效性产生影响。聚合物在体内易引起免疫反应，直接导致一系列临床不良反应的发生，包括产生抑制药物治疗效应的中和性抗体(ADA)；甚至与内源性蛋白发生交叉反应，造成严重的过敏性反应(MariaVRet.al2011.AggregatesinMonoclonalAntibodyManufacturingProcesses.BiotechnologyandBioengineering,108(7):1494-1508)。尽管一些类型的生物制品聚集体可以正常发挥功能，但维持产物品质一致性仍然重要，因为产物一致性是监管审批的先决条件。在细胞培养过程中影响抗体蛋白聚集量的因素很多，包括选择优化的细胞系和优化的细胞培养条件，如培养基的组成、补料方法、温度以及pH(MariaVRet.al2011.AggregatesinMonoclonalAntibodyManufacturingProcesses.BiotechnologyandBioengineering,108(7):1494-1508)。调节pH和温度是一种有效的手段，但可能会影响到细胞的生长以及抗体的表达量、质量。目前通过细胞培养条件优化减少抗体聚合物的研究还较少。
技术实现思路
原有细胞培养方法获得的抗体蛋白聚合物含量较高，为解决这一问题，本专利技术提供了一种降低抗PD-L1抗体中蛋白聚合物含量的细胞培养方法，其包括在允许抗PD-L1抗体产生的细胞培养条件下，在培养周期内一次或多次等量向培养基中补料添加一种或多种氨基酸。其中，补加的氨基酸选自精氨酸、赖氨酸或其组合；较优的，同时补加精氨酸和赖氨酸；在一个具体实施方案中，补加的精氨酸总量为2-8g/L培养基，赖氨酸总量为2-10g/L培养基；较优的，补加的精氨酸总量为4-6g/L培养基，赖氨酸总量为3-8g/L培养基；更优的，补加的精氨酸总量为4g/L培养基，赖氨酸总量为6g/L培养基。其中，在培养周期内补加氨基酸2-4次；在一个具体实施方案中，在培养周期的第4天、第6天、第8天及第10天中任意的2天补加氨基酸2次；在另一个具体实施方案中，在培养周期的第4天、第6天、第8天及第10天中任意的3天补加氨基酸3次；在一个具体实施方案中，在培养周期内的第4天、第6天、第8天及第10天，等量补加精氨酸总量为4g/L培养基，赖氨酸总量为6g/L培养基。在一个具体实施方案中，补加氨基酸的同时还补加氯化钙，补加总量为0.055-0.33g/L培养基。优选的，本专利技术提供的抗PD-L1抗体包含如下氨基酸序列：与SEQIDNO:1或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的重链CDR1区；与SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的重链CDR2区；与SEQIDNO:3或SEQIDNO:6所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的重链CDR3区；与SEQIDNO:7或SEQIDNO:10所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的轻链CDR1区；与SEQIDNO:8或SEQIDNO:11所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的轻链CDR2区；与SEQIDNO:9或SEQIDNO:12所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降低抗PD‑L1抗体中蛋白聚合物含量的细胞培养方法，其包括在允许抗PD‑L1抗体产生的细胞培养条件下，在培养周期内一次或多次等量向培养基中补料添加一种或多种氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种降低抗PD-L1抗体中蛋白聚合物含量的细胞培养方法，其包括在允许抗PD-L1抗体产生的细胞培养条件下，在培养周期内一次或多次等量向培养基中补料添加一种或多种氨基酸。2.权利要求1的细胞培养方法，补加的氨基酸选自精氨酸、赖氨酸或其组合。3.权利要求2的细胞培养方法，补加的精氨酸总量为2-8g/L培养基，赖氨酸总量为2-10g/L培养基。4.权利要求3的细胞培养方法，补加的精氨酸总量为4-6g/L培养基，赖氨酸总量为3-8g/L培养基。5.权利要求4的细胞培养方法，补加的精氨酸总量为4g/L培养基，赖氨酸总量为6g/L培养基。6.权利要求1的细胞培养方法，在培养周期内补加氨基酸2-4次。7.权利要求6的细胞培养方法，在培养周期的第4天、第6天、第8天及第10天中任意的2天补加氨基酸2次。8.权利要求6的细胞培养方法，在培养周期的第4天、第6天、第8天及第10天中任意的3天补加氨基酸3次。9.权利要求6的细胞培养方法，在培养周期内的第4天、第6天、第8天及第10天，等量补加精氨酸总量为4g/L培养基，赖氨酸总量为6g/L培养基。10.权利要求9的细胞培养方法，还进一步补加氯化钙，补加总量为0.055-0.33g/L培养基。11.权利要求1-10中任一项的细胞培养方法，所述抗PD-L1抗体包含如下氨基酸序列：与SEQIDNO:1或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列有至少80％同源性的重链CDR1区；与SEQIDNO:2或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列有至少80％同源性的重链CDR2区；与SEQIDNO:3或SEQIDNO:6所示的氨基酸序列有至少80％同源性的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张哲文，吕海丽，程艳菊，赵伟，张喜全，王善春，
申请(专利权)人：正大天晴药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32