一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产乳酸链球菌素的方法技术

本发明专利技术公开了一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产乳酸链球菌素的方法，包括利用静电自组装法将乳酸乳球菌原生质体包裹在有机‑无机复合脂质形成的稳定硅质体中；将壳聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，加入甘油，再加入硅质体，通过静电纺丝制得纳米纤维膜，将其成卷装入层析柱中；配制蔗糖、大豆蛋白胨、L‑抗环血酸、磷酸氢二钠和硫酸镁的混合溶液，经过滤除菌后，以一定流速流经层析柱，经检测流出液中含有乳酸链球菌素。本发明专利技术固定化细胞的方法具有高效、抗染菌、产率高、产物浓度高的特点，便于后续产物分离和纯化。

A self assembled siliceous electrospun fiber membrane immobilized cell for the production of Nisin

The invention discloses a method for self assembling silica body electrospun fiber membrane immobilized cells for nisin production, including the use of electrostatic self-assembly of Lactococcus lactis protoplasts wrapped in stable siliceous organic inorganic composite lipid formation in the body; chitosan, polyvinyl alcohol and polyethylene oxide completely dissolved in acetic acid solution, adding glycerol, adding silica body, through electrospun nanofibrous membrane, it will roll into a column; mixed solution of sucrose, soybean peptone, L ascorbic acid, two sodium hydrogen phosphate and Magnesium Sulfate, after removing bacteria, with a certain velocity flow through the chromatography column. Detection of effluent containing nisin. The method of immobilized cells of the invention has the characteristics of high efficiency, anti dyed bacteria, high yield and high concentration of product, so as to facilitate the separation and purification of subsequent products.

【技术实现步骤摘要】
一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产乳酸链球菌素的方法
本专利技术涉及一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产乳酸链球菌素的方法，属于生物化工领域。
技术介绍
乳酸链球菌素(亦称乳链菌肽)，是一种天然生物活性抗菌肽，是利用生物技术提取的一种纯天然、高效、安全的多肽活性物质。它对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用，是目前世界上唯一被允许用作食品添加剂的细菌素。固定化微生物细胞是在固定化酶的研究和应用的基础上发展起来的新技术，具有反应速度快、易于自动化等特点，不仅可以用于单一阶段的反应，而且对于多酶复合体系参与下的复杂生物合成反应更具有其独特的优点，因此，在食品饮料、酶制剂、抗生素、辅酶等的发酵生产中具有广泛的应用。硅质体是一种类脂质体，是由一个分子连接两个疏水性的碳链和一个亲水性的有机硅烷分子组成的新型脂质分子，这种分子在水中通过自组装过程形成囊泡，囊泡表面覆盖有纳米级厚度的无机硅酸盐壳层，用稳定的Si-C键将无机层和有机层二分子体连接在一起。硅质体与传统的脂质体囊泡相比，是一种非常稳定的囊泡结构，是有机-无机的杂化材料。与传统的常规脂质体相比，硅质体表面的硅氧烷网络显著增加了脂质体及固定化细胞的稳定性，对表面活性剂、酸碱都有很好的耐受性。硅质体作为固定化细胞的载体，与其他常规载体相比，可以一个硅质体就装载一个细胞，细胞被束缚在硅质体内，获得极大的机械强度，极大的比表面积和抗污染能力。静电纺丝纳米纤维膜比常规的固定化载体，具有孔隙率高，比表面积大，孔洞连通性好的特点，能够降低底物的扩散阻力，有利于提高固定化细胞的反应活性。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种具有高效、抗染菌、产率高、产物浓度高的固定化细胞方法生产乳酸链球菌素，并便于后续产物分离和纯化。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产乳酸链球菌素的方法，包括如下步骤：步骤一：制备乳酸乳球菌原生质体硅质体：称取质量比为0.1～0.2:1～3的有机-无机复合脂质与乳酸乳球菌原生质体，优选0.15:2；将有机-无机复合脂质溶于三氯甲烷中，蒸发除去三氯甲烷得到类脂质薄膜；乳酸乳球菌原生质体悬浮于甘露醇水溶液中，然后加入到所得类脂质薄膜中，搅拌混匀并迅速加热到45～50℃，优选48℃，热激10～30s同时水浴超声，冷却至4℃后静置，经脂质体挤出器挤出，得到粒径均一的乳酸乳球菌原生质体硅质体悬液；步骤二：制备纳米纤维膜：取壳聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯溶解于乙酸水溶液中，加入甘油，再加入步骤一制得的乳酸乳球菌原生质体硅质体悬液，搅拌混匀，通过静电纺丝制得纳米纤维膜，将其成卷填入带保温夹套的层析柱中；步骤三：配制蔗糖、大豆蛋白胨、L-抗环血酸、磷酸氢二钠和硫酸镁的混合水溶液，经过滤除菌后，流经步骤二制备的层析柱，收集流出液，即得。步骤一中，所述乳酸乳球菌原生质体通过如下步骤获得：步骤a：取乳酸乳球菌菌体用无菌水充分洗涤，离心取沉淀；步骤b：配制酶解液：分别取步骤a沉淀质量2～4％的溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶和崩溃酶，以质量体积比0.1:5～10g/mL加入到含有0.3～0.5mol/LKCl和0.2～0.4mol/LMgSO4的水溶液中，搅拌充分溶解，再经过滤除菌，制得酶解液；步骤c：将步骤a得到的沉淀加入到步骤b得到的酶解液中，涡旋混匀，25～30℃下水浴酶解3～8h后，离心取沉淀即得乳酸乳球菌原生质体。步骤一中，所述有机-无机复合脂质的结构式如下：该结构在硅质体中形成一层稳定的极薄且具有一定刚性的致密网状膜，可以约束原生质体，使原生质体不会因为环境渗透压的改变而破裂，极大的延长了原生质体的作用时间；另外，由于有机-无机复合脂质于磷脂结构相似，因此，硅质体结合了脂质体和二氧化硅纳米颗粒的双重优点，避免了脂质体和二氧化硅纳米颗粒各自的缺陷，能够最大限度地减少对原生质体的毒性，保证原生质体内蛋白和酶的正常生理功能，同时不会阻碍小分子物质的进出细胞。步骤一中，所述有机-无机复合脂质与三氯甲烷的混合质量体积比为100-200:10mg/mL，优选150:10mg/mL；所述甘露醇水溶液的浓度为100-180g/L，乳酸乳球菌原生质体与甘露醇水溶液的混合质量体积比为1～3:10g/mL，优选2:10g/mL；所述脂质体挤出器采用聚碳酸酯滤膜，滤膜的孔径为0.5～1.0μm，优选1.0μm。步骤二中，所述壳聚糖的粘均分子量为5.0×105，脱乙酰度为80～85％，优选85％；所述聚乙烯醇重均分子量为180000～200000，优选200000；所述聚氧化乙烯重均分子量为1×106～1×107，优选1×107；所述乙酸水溶液体积浓度为1～2％；所述壳聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯的质量比为1～2:2～4:7～9，优选2:3:8，壳聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯以总的质量浓度1.5～2％溶解于乙酸水溶液中，优选1.8％；所述甘油的加入量与乙酸水溶液的质量体积比为1～2g/L，优选1.5g/L；所述乳酸乳球菌原生质体硅质体悬液的加入量与乙酸水溶液的体积比为1:100～500，优选1:400。步骤二中，所述静电纺丝的接收装置采用铝箔，喷头到接收装置的距离为5～30cm，优选20cm；电压为3～30KV，优选20KV；喷射流量为1～5mL/h，优选1mL/h。步骤三中，所述混合水溶液中蔗糖浓度为15～30g/L，优选20g/L；大豆蛋白胨浓度为15～30g/L，优选20g/L；L-抗环血酸浓度为0.2～1.0g/L，优选0.5g/L；磷酸氢二钠浓度为5～20g/L，优选8g/L；硫酸镁浓度为0.1～0.8g/L，优选0.5g/L。步骤三中，所述混合水溶液的流速为0.2～0.5mL/h，优选0.2mL/h；层析柱夹套温度控制在27～32℃，优选30℃。有益效果：1、本申请的方法采用连续操作，操作简单，原材料转化效率高，耗时较少，可连续生物合成乳酸链球菌素。2、本申请采用硅质体作为细胞的直接载体，有效的束缚住细胞，并通过高渗溶液制备原生质体减小细胞体积，这有利于细胞在硅质体中的装载率和保持硅质体的稳定性，自组装的乳酸乳球菌原生质体硅质体，能持久保持细胞的活性，提高生产效率，降低细胞的损失率。3、本申请采用静电纺丝做成反应介质，利用其孔隙率大，扩散阻力小的优势和硅质体组合，能够获得最大的反应接触面积，发挥最大的反应效率。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。以下实施例中，乳酸链球菌素效价的HPLC检测方法如下：色谱柱采用汉邦LichrosphoreC18(4.6×250mm，5μm)，流动相：A：10％(v/v)乙腈水溶液，含0.01％(v/v)三氟乙酸；B：90％(v/v)乙腈水溶液，含0.01％(v/v)三氟乙酸。洗脱程序：0-12min，76％A相，24％B相；12-32min，A相由76％降到55％；32-40min，A相由55％上升到76％。流速为1.6mL/min，柱温室温，检测波长为220nm。孔隙率测试：取样品，精确称量其干重W0，在称量瓶中加入一定量的无水乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：制备乳酸乳球菌原生质体硅质体：称取质量比为0.1～0.2:1～3的有机‑无机复合脂质与乳酸乳球菌原生质体；将有机‑无机复合脂质溶于三氯甲烷中，蒸发除去三氯甲烷得到类脂质薄膜；乳酸乳球菌原生质体悬浮于甘露醇水溶液中，然后加入到所得类脂质薄膜中，搅拌混匀并迅速加热到45～50℃，热激10～30s同时水浴超声，冷却至4℃后静置，经脂质体挤出器挤出，得到乳酸乳球菌原生质体硅质体悬液；步骤二：制备纳米纤维膜：取壳聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯溶解于乙酸水溶液中，加入甘油，再加入步骤一制得的乳酸乳球菌原生质体硅质体悬液，搅拌混匀，通过静电纺丝制得纳米纤维膜，将其成卷填入带保温夹套的层析柱中；步骤三：配制蔗糖、大豆蛋白胨、L‑抗环血酸、磷酸氢二钠和硫酸镁的混合水溶液，经过滤除菌后，流经步骤二制备的层析柱，收集流出液，即得。

【技术特征摘要】
1.一种自组装硅质体静电纺丝纤维膜固定化细胞生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：制备乳酸乳球菌原生质体硅质体：称取质量比为0.1～0.2:1～3的有机-无机复合脂质与乳酸乳球菌原生质体；将有机-无机复合脂质溶于三氯甲烷中，蒸发除去三氯甲烷得到类脂质薄膜；乳酸乳球菌原生质体悬浮于甘露醇水溶液中，然后加入到所得类脂质薄膜中，搅拌混匀并迅速加热到45～50℃，热激10～30s同时水浴超声，冷却至4℃后静置，经脂质体挤出器挤出，得到乳酸乳球菌原生质体硅质体悬液；步骤二：制备纳米纤维膜：取壳聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯溶解于乙酸水溶液中，加入甘油，再加入步骤一制得的乳酸乳球菌原生质体硅质体悬液，搅拌混匀，通过静电纺丝制得纳米纤维膜，将其成卷填入带保温夹套的层析柱中；步骤三：配制蔗糖、大豆蛋白胨、L-抗环血酸、磷酸氢二钠和硫酸镁的混合水溶液，经过滤除菌后，流经步骤二制备的层析柱，收集流出液，即得。2.根据权利要求1所述的生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于，步骤一中，所述乳酸乳球菌原生质体通过如下步骤获得：步骤a：取乳酸乳球菌菌体用无菌水洗涤，离心取沉淀；步骤b：配制酶解液：分别取步骤a沉淀质量2～4％的溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶和崩溃酶，以质量体积比0.1:5～10g/mL加入到含有0.3～0.5mol/LKCl和0.2～0.4mol/LMgSO4的水溶液中，搅拌溶解，再经过滤除菌，制得酶解液；步骤c：将步骤a得到的沉淀加入到步骤b得到的酶解液中，涡旋混匀，25～30℃下水浴酶解3～8h后，离心取沉淀即得乳酸乳球菌原生质体。3.根据权利要求1所述的生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于，步骤一中，所述有机-无机复合脂质的结构式如下：4.根据权利要求1所述的生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤佳鹏，葛彦，傅海洪，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32