可应用于循环对接移植的部分胰腺去细胞化生物支架、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种可应用于循环对接移植的部分胰腺去细胞化生物支架、制备方法及其应用，生物支架以胰腺体尾部作为去细胞化灌注的主体，以腹腔干动脉作为灌注入路，以脾静脉主干或门静脉作为灌注出路，经过去细胞化后获得。制备方法包括：1.制备该支架模型所需的部分胰腺，即胰腺体尾部的获取方式及去细胞化灌注的入路和出路的确立；2.去细胞化的具体流程和具体灌注液；3.该生物支架应用于体内循环对接移植的具体方式。本发明专利技术所涉及的去细胞化生物支架去除细胞彻底，脉管结构和外基质成分完整保留，更具创新的是该胰腺生物支架具备单一独立的动脉入路和静脉出路，且密闭性良好，具备体内循环对接移植的独特应用价值。

Biologic scaffolds, preparation methods and applications of partial pancreatic acellular biodegradable scaffolds for circulatory docking transplantation

The invention discloses a method can be applied to circulating butt transplantation part of pancreatic decellularized scaffold, preparation method and application thereof, scaffold to the body and tail of pancreas as subject to cell perfusion, the celiac artery perfusion as approach to splenic vein or portal vein perfusion as a way to get through. Cells after. The preparation method comprises: preparing the 1. part of the pancreatic stent model required, namely, the body and tail of pancreas and to obtain cell perfusion approach and the way to establish 2.; cell specific processes and specific perfusion fluid; the 3. specific biological scaffolds used in circulating butt transplantation. The invention relates to cell scaffold to remove cells completely, vascular structure and extracellular matrix components intact, more innovative is the scaffold with a single pancreatic artery and vein into the road way, and good sealing performance, with circulating butt the unique application value of transplantation.

【技术实现步骤摘要】
可应用于循环对接移植的部分胰腺去细胞化生物支架、制备方法及其应用
本专利技术涉及组织工程和再生医学研究，具体涉及可应用于循环对接移植的部分胰腺去细胞化生物支架、制备方法及其应用。
技术介绍
器官移植是针对所有导致器官功能不可逆衰竭疾病的金标准治疗方式，然而我们面临着供体严重短缺的困境。组织工程和再生医学研究通过功能性组织或者器官的再造来替代或部分替代正常的器官功能，从而在临床器官移植中发挥史无前例的作用。其核心的技术之一就是器官去细胞化灌注技术，即通过去除了器官内部的细胞成分，从而获得保留天然的脉管结构和基质成分生物支架结构，有助于特定细胞的分化、增殖，从而构建功能性组织/器官。因此去细胞化生物支架非常适合组织工程学的研究应用。糖尿病是一个全球性的慢性疾病，全世界有超过4亿的人患有糖尿病。目前I型糖尿病的治疗主要是依靠长期胰岛素注射，但并不能完全获得缓解，也不能延缓糖尿病并发的多脏器功能受累。基于胰腺去细胞化生物支架结构的应用为基础的胰腺再生和组织工程领域的研究是构建可移植胰腺的一条创新性途径，为未来糖尿病的彻底根治提供了令人鼓舞的希望，然而由于解剖上胰腺器官的多重动脉供血及胰头部与十二指肠之间紧密的包绕和广泛的交通支，使得现有的全胰腺去细胞化生物支架模型存在以下两大严重缺陷：1.可供移植的出入路脉管不清晰；2.支架缺乏良好的循环密闭性。因此，尽管目前有不少关于全胰腺去细胞化生物支架的制备和应用的文献报道，但是真正涉及其体内移植相关的应用研究却鲜有报道。中国专利技术专利CN104353115A公开了一种“用于胰腺脱细胞支架的试剂盒、支架的制备及再种植方法”（申请号：201410590216.8），该方案所涉及的方法所制备的胰腺脱细胞支架是以门静脉为灌注入路的全胰腺去细胞化支架模型，与国内外其他类似的全胰腺支架一样，并未克服上述所提及的两大缺陷。因此，该专利涉及的胰腺脱细胞支架仅可较好的应用于胰腺组织工程的体外再细胞化研究，但却无法真正有效的应用于的体内移植应用研究。正如该专利中显示的，并无任何体内移植应用研究相关的阐述。组织工程和再生医学的研究其最终目的是构建可移植的器官/组织，方可应用于临床，因此，现有的全胰腺生物支架模型并不是胰腺组织工程学研究的最佳应用载体。
技术实现思路
本专利技术旨在为了克服现有技术存在可供移植的出入路脉管不清晰、支架缺乏良好的循环密闭性的不足，而公开一种可应用于循环对接移植的部分胰腺去细胞化生物支架。为了实现本专利技术的目的，本专利技术公开了一种可应用于循环对接移植的部分胰腺去细胞化生物支架，其特征在于：以胰腺体尾部作为去细胞化灌注的主体，以腹腔干动脉作为灌注入路，以脾静脉主干或门静脉作为灌注出路，经过去细胞化后获得；或以胃左动脉主干作为灌注入路，以脾静脉主干或门静脉作为灌注出路，经过去细胞化后获得。本专利技术的另一个目的在于提供一种上述部分胰腺去细胞化生物支架的制备方法。为此，本专利技术的技术解决方案是：部分胰腺去细胞化生物支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）胰腺体尾部的获取及去细胞化灌注的入路和出路的确立经胃左动脉插入导管，导管接蠕动泵持续灌注肝素钠溶液（12500U肝素钠+500ml生理盐水），结扎离断腹腔干动脉和肝总动脉，将全胰腺分为肉眼可明显区分的头部和体尾部两部分；沿胰腺头部和体尾部的自然分界线仔细将胰腺头部和体尾部分开，并结扎阻断胰腺和脾脏之间的交通血管，脾脏暂保留作为灌注过程中的解剖参照，注意保护胰腺体尾部包膜的密闭和完整，在汇入门静脉水平离断脾静脉，游离胰腺体尾部周围的疏松结缔组织后获取制备该生物支架的主体结构—胰腺体尾部，整个游离过程在肝素钠溶液的持续灌注下进行以防止胰腺微血管血栓形成；胃左动脉主干是该主体结构的去细胞化灌注入路，而脾静脉主干是该主体结构的灌注出路；在结扎离断肝总动脉的前提下，结扎离断胃左动脉而以腹腔干动脉作为灌注入路并以脾静脉或门静脉作为灌注出路；2）去细胞化具体灌注液1）1×PBS:即0.1MPBS，氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾O.24g，加800ml去离子水，用lM的HCL或NaOH调pH，定容lL；2）2×PBS:即0.2MPBS，氯化钠16g，氯化钾O.4g，磷酸氢二钠2.88g，磷酸二氢钾0.48g，加800ml去离子水，用1M的HCL或NaOH调pH，定容lL；3）0.02％胰酶/0.05％EDTA溶液：胰酶0.25g，EDTA（乙二胺四乙酸）500mg加100mlO.1MPBS，配制成0.25％胰酶/0.5％EDTA（乙二胺四乙酸）溶液，然后以O.1MPBS液稀释lO倍；4）1%Triton-X100/O.05%EDTA溶液：Triton-X10010ml，EDTA500mg，加970ml0.1MPBS；5）0.1％SDS溶液：SDS（十二烷基硫酸钠）1g，加1000ml0.1MPBS。6）DnaseI溶液：脱氧核糖核酸酶I,以0.1MPBS为溶剂，配置成浓度为1ug/ml的DnaseI溶液；具体去细胞化流程：.冻融：将离体的胰腺体尾部放置在负80冰箱过夜，第二天自然解冻，完成灌注前的冻融操作；.灌注流程：室温下，以2ml/min的流速经入路导管依次灌注0.02%胰酶/0.05%EDTA溶液（30min）、双蒸水（15min）、2×PBS液（15min）、1%Triton-X100/0.05%EDTA溶液（180min）、0.1%SDS溶液（30min）、DnaseI溶液（60min）、2×PBS溶液（15min）、1×PBS溶液（15min），完成灌注流程，获得胰腺体尾部去细胞化生物支架；.消毒和灭菌：采用γ射线对胰腺体尾部去细胞化生物支架进行辐照灭菌。本专利技术胰腺去细胞化生物支架选择胰腺体尾部作为去细胞化灌注的主体，摈弃了与十二指肠的关系复杂的胰腺头部，所制备的去细胞化生物支架具备单一独立的动脉入路和静脉出路，密闭性良好，因此妥善的解决了全胰腺支架存在的支架结构可供移植的出入路脉管不清晰和支架缺乏良好的循环密闭性两大关键问题，具备体内循环对接移植的独特应用价值。本专利技术的制备方法通过解剖学处理，即经胃左动脉置入导管，结扎离断腹腔干动脉及肝总动脉，导管接蠕动泵持续灌注肝素钠溶液，根据肝素钠灌注下胰腺头部和体尾部的自然分界进行分离，选择胰腺体尾部作为去细胞化灌注的主体，即简化了手术游离操作程序，且去除细胞彻底，脉管结构和外基质成分完整保留。同时本专利技术也提供了该生物支架应用于体内循环对接移植的具体方式，即将特定的种子细胞通过循环灌注培养的方式种植入胰腺体尾部去细胞化生物支架内，再将生物支架的动脉入路和静脉出路分别和受体同侧的肾脏动、静脉完成对接（包括端端/端侧吻合或者导管嵌套式连接等），从而完成供体和受体的循环对接移植。附图说明图1：是大鼠正常胰腺及其临近组织示意图；图2：A-B示意大鼠胰腺体尾部作为灌注主体结构的确立方法；C虚线框内所示为获取大鼠胰腺体尾部后的动脉灌注系统，红色箭头代表灌注方向；D虚线框内所示为获取大鼠胰腺体尾部后的静脉出路系统，蓝色箭头代表灌注液流出方向；图3：A/B是胰腺体尾部去细胞化前后的HE染色结果；C/D是胰腺体尾部去细胞化前后的免疫组化染色结果；图4：A是胰岛细胞植入该胰腺生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
可应用于循环对接移植的部分胰腺去细胞化生物支架，其特征在于：以胰腺体尾部作为去细胞化灌注的主体，以腹腔干动脉作为灌注入路，以脾静脉主干或门静脉作为灌注出路，经过去细胞化后获得。

【技术特征摘要】
1.可应用于循环对接移植的部分胰腺去细胞化生物支架，其特征在于：以胰腺体尾部作为去细胞化灌注的主体，以腹腔干动脉作为灌注入路，以脾静脉主干或门静脉作为灌注出路，经过去细胞化后获得。2.一种权利要求1所述的部分胰腺去细胞化生物支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）胰腺体尾部的获取及去细胞化灌注的入路和出路的确立经胃左动脉插入导管，导管接蠕动泵持续灌注肝素钠溶液，结扎离断肝总动脉和胃左动脉，将全胰腺分为肉眼可明显区分的头部和体尾部两部分；沿胰腺头部和体尾部的自然分界线仔细将胰腺头部和体尾部分开，并结扎阻断胰腺和脾脏之间的交通血管，注意保护胰腺体尾部包膜的密闭和完整，在汇入门静脉水平离断脾静脉，游离胰腺体尾部周围的疏松结缔组织后获取制备该生物支架的主体结构—胰腺体尾部，整个游离过程在肝素钠溶液的持续灌注下进行以防止胰腺微血管血栓形成；，以腹腔干动脉为该主体结构的去细胞化灌注入路，而以腹腔干动脉为该主体结构的灌注出路；2）去细胞化具体灌注液1）1×PBS:即0.1MPBS，氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾O.24g，加800ml去离子水，用lM的HCL或NaOH调pH，定容lL；2）2×PBS:即0.2MPBS，氯化钠16g，氯化钾O.4g，磷酸氢二钠2.88g，磷酸二氢钾0.48g，加800ml去离子水，用1M的HCL或NaOH调pH，定容lL；3）0.02％胰酶/0.05％EDTA溶液：胰酶0.25g，EDTA（乙二胺四乙酸）500mg加100mlO.1MPBS，配制成0.25％胰酶/0.5％EDTA（乙二胺四乙酸）溶液，然后以O.1MPBS液稀释lO倍；4）1%Triton-X100/O.05%EDTA溶液：Triton-X10010ml，EDTA500mg，加970ml0.1MPBS；5）0.1％SDS溶液：SDS（十二烷基硫酸钠）1g，加1000ml0.1MPBS；6）DnaseI溶液：脱氧核糖核酸酶I,以0.1MPBS为溶剂，配置成浓度为1ug/ml的DnaseI溶液；具体去细胞化流程：.冻融：将离体的胰腺体尾部放置在负80冰箱过夜，第二天自然解冻，完成灌注前的冻融操作；.灌注流程：室温下，以2ml/min的流速经入路导管依次灌注0.02%胰酶/0.05%EDTA溶液30min、双蒸水15min、2×PBS液15min、1%Triton-X100/0.05%EDTA溶液180min、0.1%SDS溶液30min、DnaseI溶液60min、2×PBS溶液15min、1×PBS溶液5min，完成灌注流程，获得胰腺体尾部去细胞化生物支架；.消毒和灭菌：采用γ射线对胰腺体尾部去细胞化生物支架进行辐照灭菌。3.可应用于循环对接移植的部分胰腺去细胞化生...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈云志，周蒙滔，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33