一种人胰岛素类似物前体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种人胰岛素类似物前体及其制备方法。具体而言，本发明专利技术涉及一种含有新型连接肽的人胰岛素类似物前体及其制备方法，该新型人胰岛素类似物前体可以在酵母中高表达且下游的纯化方法简单易操作。

【技术实现步骤摘要】
一种人胰岛素类似物前体及其制备方法
本专利技术涉及一种人胰岛素类似物前体及其制备方法，属于生化与分子生物学的领域，应用的技术包括分子构建信息、细胞筛选、发酵工艺等。
技术介绍
糖尿病是胰岛素分泌缺陷或者胰岛素抵抗导致的以高血糖为特征的代谢紊乱疾病，该病目前已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的大三大危害性疾病。临床中将糖尿病分为四类，即Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、其他特殊类型糖尿病和妊娠糖尿病、继发性糖尿病，胰岛素(insulin，Ins)是主要应用于所有Ⅰ型糖尿病及大多数Ⅱ型糖尿病的治疗药物。胰岛素是由胰腺β细胞分泌的多肽激素，它由两条多肽链A和B组成，这两条多肽链是通过两个链间二硫键相连的。该激素是以单链前体胰岛素原(前胰岛素原)的形式合成的，构型如下：前肽-B-ArgArg-C-LysArg-A，其中C是31个氨基酸的连接肽，Arg-Arg和Lys-Arg是由A和B链切除连接肽的切割位点。胰岛素前体是指通过一个或多个随后的化学和/或酶促步骤可以转变成人胰岛素的单链多肽。胰岛素类似物前体是指A和/或B链相对于人胰岛素分子具有一个或多个突变、替代、删除、和/或添加的胰岛素前体分子。已知的获取胰岛素的方法包括动物组织提取和基因工程表达，而采用基因工程表达人胰岛素及其类似物早已成为工业主流手段。基因工程中表达胰岛素的微生物主要分为2类，分别是大肠杆菌、及酵母菌。大肠杆菌表达为包涵体形式，需经过包涵体裂解和复性，工艺繁琐且产率低。最常用的酵母菌分酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母，二者均具有相同的遗传表达优点，但后者外源蛋白表达水平是前者10倍以上。目前已公开了一系列在天然人胰岛素序列的不同位点上有氨基酸取代的胰岛素类似物。例如：EP0425482B1公开了一种在B25位上有His或Tyr取代的胰岛素类似物。EP0419504B1公开了一种在B3有取代，同时在A5或A15有Gln取代，或在A18或A21有Asn取代的胰岛素类似物。US5008241A公开了一种在A21有特定氨基酸取代，同时在A4、A17、B13或B21有特定氨基酸取代的胰岛素类似物。CN100432104C公开了胰岛素B链B30缺失的胰岛素类似物前体的结构，但是通过该方法制得的胰岛素类似物中B链只有29个氨基酸，需通过体外酶促流程添加期望的B30氨基酸残基或者通过对B29为氨基酸残基进行其他基团修饰的方法才能得到与胰岛素活性相同的胰岛素类似物。CN101243190A公开了一种通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备成熟人胰岛素类似物的方法，所述的前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌争取加工的成熟、双链人胰岛素类似物，该申请中，连接肽的大小为3-35个氨基酸。但是，提供活性好的新的胰岛素类似物及通过提高发酵液中胰岛素类似物前体的产量、简化下游纯化工艺来降低生产成本仍是亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新型的人胰岛素类似物前体，该类似物具有新的连接肽，在发酵时表达量较高，同时下游的处理方法比较简单，通过较为常规的纯化及酶切步骤就可以制备出对应的新型胰岛素类似物。本专利技术所述的人胰岛素类似物前体分子含有连接胰岛素A链和B链的连接肽(C肽),可以通过简单的酶切方法将所述胰岛素类似物前体转变成胰岛素类似物。本专利技术所述的人胰岛素类似物前体分子的连接肽C端和N端分别是K或R，或由K和R任意组合的一对碱性氨基酸残基，优选单个碱性氨基酸残基K或R，特别地，当连接肽C端和N端分别是K或R时，所述人胰岛素类似物前体可在宿主菌内被酶切为胰岛素类似物。本专利技术所述连接肽包含有至少一个芳香族氨基酸残基F、W或Y，此外，还包含氨基酸残基个数选自0、1、2、3、4、5的一段非特异性氨基酸残基。具体来说，本专利技术涉及具有如下通式的人胰岛素类似物前体：B(1-27)-D-K-E-X1-X3-Y1-X2-A(1-21)其中，A(1-21)(SEQIDNO.1)是天然人胰岛素A链氨基酸序列，B(1-27)(SEQIDNO.2)是缺失B28、B29、B30位氨基酸残基的天然人胰岛素B链，X1-X3-Y1-X2为连接胰岛素B链和A链的连接肽，X1、X2是1-2个氨基酸残基，并且各自独立选自K、R、RK、KR、RR、KK；X3选自芳香族氨基酸F、W或Y；Y1选自0、1、2、3、4、5个氨基酸残基，优选1-5个，最优选1-3个。该领域普遍认知的，连接肽C端和N端的K或R可以由胰蛋白酶和羧肽酶B识别并进行切割，从而切除C肽。本专利技术提供的的人胰岛素类似物前体分子X1-X3-Y1-X2位氨基酸可选自但不限于以下组：(1)KFK；(2)KWK；(3)RWR；(4)RFR；(5)RFKR；(6)KWRK；(7)KFRK；(8)RWER；(9)KRFEKR；(10)RFEKR；(11)RWGYPGVR；(12)KWAAK；(13)KFAAK；(14)KYAAK；(15)RWAKR；(16)RWLER；(17)KFMEK；(18)KWMEAAK。本专利技术还涉及编码上述人胰岛素类似物前体的核苷酸序列，含有这些核苷酸序列的重组载体。本专利技术中所述的表达载体选自pPIC9K、pPICZK、pPIC3.5K、pET9a、pET28a，优选pPIC9K、pPICZK。转化上述核苷酸序列或载体到宿主细胞也是本专利技术的一部分，本专利技术中所述的宿主细胞可选自酵母菌或大肠杆菌。当选用大肠杆菌为宿主细胞时，本领域常用的EscherichiacoliDH5a、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)、JM109、HSM174(DE3)包含在内。选用酵母菌做宿主细胞时，优选毕赤酵母或酿酒酵母，最优选毕赤酵母，其中毕赤酵母的种类可以是毕赤酵母GS115、毕赤酵母X33等，酿酒酵母的种类可以是酿酒酵母INVSc1、酿酒酵母MT663等。本专利技术提供的人胰岛素类似物前体可以具有N端氨基酸残基延伸的形式表达，即在胰岛素类似物核苷酸序列的5’端添加几个氨基酸残基的密码子核苷酸序列，连接到载体并转化到宿主细胞中表达。所述N端延伸的氨基酸残基一般称为间隔肽，可以保护人胰岛素类似物前体的N端免于酵母蛋白酶的水解作用。间隔肽C端为碱性氨基酸，可以通过对碱性氨基酸特异水解的蛋白酶(如胰蛋白酶)切除。所述间隔肽氨基酸序列例如EEGEPK或EEAEAEAEPK等。本专利技术提供的人胰岛素类似物前体相对于对照人胰岛素类似物前体在宿主细胞的表达产量有显著提高。其中所述对照人胰岛素类似物前体与本专利技术所述人胰岛素类似物前体B链和A链相同但连接肽不同，其氨基酸序列为B(1-27)-DKE-KAAK-A(1-21)(SEQIDNO.4)。此外，本专利技术还提供了获得所述人胰岛素类似物前体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)合成可编码上述人胰岛素类似物前体的DNA序列；(2)将编码所述人胰岛素类似物前体的核苷酸连接到表达载体；(3)将重组载体转化到宿主细胞，构建重组菌；(4)在适宜培养条件下培养重组菌，并诱导人胰岛素类似物前体的的分泌表达。本专利技术还提供了获得结构式为B(1-27)-D-K-E-A(1-21)(SEQIDNO.3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人胰岛素类似物前体，其包含通式：B(1‑27)‑D‑K‑E‑X1‑X3‑Y1‑X2‑A(1‑21)其中，A(1‑21)是天然人胰岛素A链；B(1‑27)是缺失B28、B29、B30位氨基酸残基的天然人胰岛素B链,其特征在于：X1是1‑2个氨基酸残基；X2是1‑2个氨基酸残基；X3选自F、W或Y；Y1的氨基酸残基数量选自0、1、2、3、4、5。

【技术特征摘要】
2016.05.31 CN 20161037562171.一种人胰岛素类似物前体，其包含通式：B(1-27)-D-K-E-X1-X3-Y1-X2-A(1-21)其中，A(1-21)是天然人胰岛素A链；B(1-27)是缺失B28、B29、B30位氨基酸残基的天然人胰岛素B链,其特征在于：X1是1-2个氨基酸残基；X2是1-2个氨基酸残基；X3选自F、W或Y；Y1的氨基酸残基数量选自0、1、2、3、4、5。2.根据权利要求1所述的人胰岛素类似物前体，其特征在于：X1、X2各自独立选自K、R、RK、KR、RR、KK。3.根据权利要求1所述的人胰岛素类似物前体，其特征在于Y1的氨基酸残基数量任选自1-5个，优选1-3个。4.根据权利要求1所述的人胰岛素类似物前体，其中X1-X3-Y1-X2选自以下组：(1)KFK；(2)KWK；(3)RWR；(4)RFR；(5)RFKR；(6)KWRK；(7)KFRK；(8)RWER；(9)KRFEKR；(10)RFEKR；(11)RWGYPGVR；(12)KWAAK；(13)KFAAK；(14)KYAAK；(15)RWAKR；(16)RWLER；(17)KFMEK；(18)KWMEAAK。5.一种编码权利要求1至4任一项所述的人胰岛素类似物前体的DNA序列。6.一种含有权利要求5所述的DNA序列的表达载体。7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菲菲，王宏伟，曾翔，赵亮亮，牛宁宁，王亚里，田静，
申请(专利权)人：江苏恒瑞医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32