一种C‑肽免疫抗原和抗C‑肽多克隆抗体及其制备与应用制造技术

本发明专利技术属于免疫学技术领域，具体涉及一种C‑肽免疫抗原和抗C‑肽多克隆抗体及其制备与应用。本发明专利技术采用间接偶联法以C‑肽作为半抗原与载体蛋白多聚赖氨酸偶联制得C‑肽免疫抗原，然后采用该C‑肽免疫抗原免疫兔子，取血，离心得到抗血清，即为抗C‑肽多克隆抗体，进一步采用辛酸‑硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体，纯化效果好，得到的抗C‑肽多克隆抗体纯净，纯度可达到90％以上，可用于检测人体血清中的C‑肽，以此判断糖尿病分型；可用于C‑肽的快速免疫检测，具有良好的应用价值。且发明专利技术制备方法简便，成本低廉。

A C peptide antigen and anti C peptide polyclonal antibody and its preparation and Application

The invention belongs to the technical field of immunology, in particular to a C peptide antigen and anti C peptide polyclonal antibody and its preparation and application. The invention adopts the indirect coupling method with C peptide as a hapten and carrier protein polylysine coupling system C peptide antigen, and then using the C peptide immunized rabbits, blood is centrifuged to obtain antiserum against C peptide polyclonal antibody, further by symplectic acid sulfate the polyclonal antibodies were purified by precipitation of ammonium, good purification effect, anti C polyclonal antibody was obtained peptide purity, purity can reach more than 90%, can be used for C peptide detection in human serum, in order to determine the type of diabetes; can be used for rapid detection of immune C peptide, has good application value. The invention has the advantages of simple preparation method and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种C-肽免疫抗原和抗C-肽多克隆抗体及其制备与应用
本专利技术属于免疫学
，具体涉及一种C-肽免疫抗原和抗C-肽多克隆抗体及其制备与应用。
技术介绍
C肽是含31个氨基酸的多肽，它和胰岛素的A、B链组成胰岛素原，是A、B链的连接链，在胰岛素原分子的折叠，二硫键的正确配对中起重要作用。C肽由胰岛素原裂解产生，一分子胰岛素原合成一分子C肽与一分子的A、B链，后二者合成胰岛素。C肽与胰岛素共同存在于同一颗粒囊内最终以等分子分泌。C肽不通过肝酶代谢，而主要经过肾脏清除，其清除速率慢，半衰期为20min，明显较长，其基础水平平均值为0.4nml/l，当人进食葡萄糖后1h升至1.68nmol/l，反映早期的胰岛素功能，3h降至0.65nmol/l。故检测人血清中的C-肽，能准确测定血循环中C肽水平，能反映β细胞合成与释放胰岛素功能。糖尿病是一组由胰岛素分泌绝对或相对不足所导致的以慢性高血糖为特征的代谢综合征。最新研究显示，该疾病在中国成年人群中，约有9240万例病例，占总人口数的9.7％，此外，另有1482万成年人具有前驱糖尿病症状，约占总人口数的1.55％。目前临床诊断筛查中，血清C肽水平对糖尿病的分型诊断、治疗方案选择和疗效监测具有重要的临床参考意义，是筛查诊断糖尿病患者主要的常规必检项目，此外，对于胰岛素瘤的诊断亦有重要参考价值。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种C-肽免疫抗原的制备方法，该制备方法以C-肽作为原料偶联载体蛋白多聚赖氨酸(PLL)制得C-肽免疫抗原。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的C-肽免疫抗原。本专利技术的再一目的在于提供一种抗C-肽多克隆抗体，该抗C-肽多克隆抗体利用上述C-肽免疫抗原制备。本专利技术的第四个目的在于提供上述C-肽免疫抗原和抗C-肽多克隆抗体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种C-肽免疫抗原的制备方法，包含如下步骤：(1)8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂的合成：将王树脂和赖氨酸混合进行偶联合成，得到8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂；(2)树脂裂解和去保护：将步骤(1)制得的8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂与裂解试剂混合，然后搅拌反应；反应后将反应液过滤，收集滤液，浓缩，浓缩物用水溶解并用乙醚萃取，得到七聚赖氨酸水溶液；(3)七聚赖氨酸的分离与纯化：采用高效反相液相色谱仪对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离，检测280nm吸收值，收集主峰析出液，浓缩，干燥，得到七聚赖氨酸；(4)将步骤(3)制得的七聚赖氨酸与MBS(3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯)混合，搅拌反应，得到MBS活化的七聚赖氨酸；将C-肽与MBS活化的七聚赖氨酸混合，搅拌反应，得到C-肽免疫抗原粗品；(5)在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，将甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯依次滴加到Fmoc-Cys-OH中，反应5～10min；加入乙酸酐，在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1～1.5h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应15～30min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取，将Fmoc-Cys-OH以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍Fmoc-Cys-OH质量的硅胶，混匀，并干燥；(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的C-肽免疫抗原粗品溶于PBS缓冲液，然后使用中压过柱，采用PBS缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4-甲基-3-硝基苯胺反应，产物用PBS缓冲液洗涤；洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30～60min，得到C-肽免疫抗原；步骤(1)中所述的王树脂和赖基酸的摩尔比优选为1∶7；步骤(1)中所述的偶联合成的具体操作优选为：以DCM溶涨树脂，然后按照去保护、活化、偶联步骤，在ABI431多肽合成仪上依次连接第1级到第3级赖氨酸；步骤(2)中所述的裂解试剂优选包含如下组分：TFA900mL/L、苯甲硫醚50mL/L、二巯基乙烷30mL/L、苯甲醚20mL/L；步骤(2)中所述的搅拌反应的时间优选为2h；步骤(2)中所述的浓缩优选为低压旋转浓缩；步骤(2)中所述的乙醚的用量优选为与水等体积；步骤(3)中所述的分离的具体操作优选为：在WatersDelta600高效反相液相色谱仪上，选用C18制备柱(Phenomenex，300i，15μm，ID4.6mm×250mm)，以梯度洗脱方式进行分离，486检测器检测280nm吸收值，收集主峰析出液；其中，流动相A为1mL/LTFA/H2O，流动相B为1mL/LTFA/乙晴；步骤(3)中所述的浓缩优选为低压旋转浓缩；步骤(3)中所述的干燥优选为冷冻干燥；步骤(4)中所述的C-肽和七聚赖氨酸的摩尔比优选为≥16∶1；步骤(4)中所述的MBS活化的七聚赖氨酸优选通过如下步骤制备得到：将0.002mmol步骤(3)制得的七聚赖氨酸与1mLPBS缓冲液混合，得到七聚赖氨酸溶液；将10mgMBS溶于100μLDMF中，得到MBS/DMF溶液；搅拌状态下，将MBS/DMF溶液滴加到七聚赖氨酸溶液中，加完后，于室温中搅拌反应2h；步骤(4)中所述的C-肽免疫抗原粗品优选通过如下步骤制备得到：将60mgC-肽溶解于2mLPBS缓冲液中，得到C-肽溶液；搅拌状态下，将C-肽溶液滴加到MBS活化的七聚赖氨酸中，加完后于室温中搅拌反应3h；步骤(5)中所述的Fmoc-Cys-OH、甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯的体积比优选为1:1:1；步骤(5)中所述的乙酸酐的用量优选为100mg/100μLFmoc-Cys-OH；步骤(5)中所述的氯甲酸异丁酯加时需慢速滴加，以控制反应体系温度，滴加速度优选为20～30滴/min；步骤(5)中所述的水和乙酸乙酯萃取的次数优选为2～3次；步骤(5)中所述的碳酸氢钠溶液萃取的次数优选为2～3次；步骤(5)中所述的水萃取的次数优选为2～3次；步骤(6)中所述的中压优选为5～10Mpa；所述的PBS缓冲液浓度优选为0.1mol/L，pH优选为7.0；一种C-肽免疫抗原，通过上述制备方法制备得到；一种抗C-肽多克隆抗体，利用上述C-肽免疫抗原制备得到；所述的抗C-肽多克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：采用步骤(1)合成的C-肽免疫抗原免疫兔子，取血，离心得到抗血清，即为抗C-肽多克隆抗体；所述的抗C-肽多克隆抗体的制备方法还包括纯化步骤：将上述抗血清加入25μL/mL的辛酸溶液中，混匀，然后离心，收集上清液，将滤液用10×PBS缓冲液混合，在2～4℃下缓慢加入硫酸铵，使其终浓度为40～45％w/w；离心，收集沉淀；沉淀用PBS缓冲液溶解，置于PBS缓冲液中透析然后干燥，得到C-肽多克隆抗体；所述的PBS缓冲液浓度为0.01mol/l，pH为7.4；所述的离心优选为8000～10000r/min，离心15～30min；所述的透析的条件优选为透析3～4天，10～14小时换一次液；所述的干本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种C‑肽免疫抗原的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂的合成：将王树脂和赖氨酸混合进行偶联合成，得到8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂；(2)树脂裂解和去保护：将步骤(1)制得的8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂与裂解试剂混合，然后搅拌反应；反应后将反应液过滤，收集滤液，浓缩，浓缩物用水溶解并用乙醚萃取，得到七聚赖氨酸水溶液；(3)七聚赖氨酸的分离与纯化：采用高效反相液相色谱仪对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离，检测280nm吸收值，收集主峰析出液，浓缩，干燥，得到七聚赖氨酸；(4)将步骤(3)制得的七聚赖氨酸与MBS混合，搅拌反应，得到MBS活化的七聚赖氨酸；将C‑肽与MBS活化的七聚赖氨酸混合，搅拌反应，得到C‑肽免疫抗原粗品；(5)在‑15～‑20℃盐水浴，氮气保护下，将甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯依次滴加到Fmoc‑Cys‑OH中，反应5～10min；加入乙酸酐，在‑15～‑20℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1～1.5h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应15～30min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取，将Fmoc‑Cys‑OH以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍Fmoc‑Cys‑OH质量的硅胶，混匀，并干燥；(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的C‑肽免疫抗原粗品溶于PBS缓冲液，然后使用中压过柱，采用PBS缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4‑甲基‑3‑硝基苯胺反应，产物用PBS缓冲液洗涤；洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30～60min，得到C‑肽免疫抗原；步骤(1)中所述的王树脂和赖基酸的摩尔比为1∶7。...

【技术特征摘要】
1.一种C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂的合成：将王树脂和赖氨酸混合进行偶联合成，得到8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂；(2)树脂裂解和去保护：将步骤(1)制得的8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂与裂解试剂混合，然后搅拌反应；反应后将反应液过滤，收集滤液，浓缩，浓缩物用水溶解并用乙醚萃取，得到七聚赖氨酸水溶液；(3)七聚赖氨酸的分离与纯化：采用高效反相液相色谱仪对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离，检测280nm吸收值，收集主峰析出液，浓缩，干燥，得到七聚赖氨酸；(4)将步骤(3)制得的七聚赖氨酸与MBS混合，搅拌反应，得到MBS活化的七聚赖氨酸；将C-肽与MBS活化的七聚赖氨酸混合，搅拌反应，得到C-肽免疫抗原粗品；(5)在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，将甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯依次滴加到Fmoc-Cys-OH中，反应5～10min；加入乙酸酐，在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1～1.5h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应15～30min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取，将Fmoc-Cys-OH以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍Fmoc-Cys-OH质量的硅胶，混匀，并干燥；(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的C-肽免疫抗原粗品溶于PBS缓冲液，然后使用中压过柱，采用PBS缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4-甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵肃清，吕瑞，卢业玉，钟文颖，夏娜娜，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44