一种用于BHK细胞的无血清培养基制造技术

本发明专利技术提供一种用于BHK细胞的无血清培养基，具体地，所述培养基包括：氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂、添加剂，该培养基有利于产物的分离纯化，提高产品品质；支持BHK细胞长期传代培养，无需长期而复杂的适应过程；能良好地支持BHK细胞的悬浮生长，配置和使用容易，适于生物制品的大规模生产。

A serum-free medium for BHK cells

The present invention provides a method for serum-free medium, BHK cells specifically, the culture medium including amino acids, vitamins, salts, lipids, trace elements, protein hydrolysate, buffer, pH indicator, additive, the culture medium is conducive to the purification of product, improve product quality; support BHK cell passaged for a long time culture, without a long and complicated process of adaptation; suspension can be a good way to support the growth of BHK cells in configuration and easy to use, suitable for mass production of biological products.

【技术实现步骤摘要】
一种用于BHK细胞的无血清培养基
本专利技术涉及细胞培养领域，更具体地，本专利技术涉及用于BHK21细胞培养的无血清培养基及相应的培养方法。
技术介绍
口蹄疫是人畜共患病，是一种高度传染的病毒性疾病.被国际兽医局列为全世界主要防治的动物病疫类之首。口蹄疫一旦暴发，能迅速演变为生物灾害，直接受到重大甚至于毁灭性打击的是畜牧业及相关产业，大批动物被扑杀销毁，引发严重的公共卫生问题，造成社会的恐慌。1999—2001年，口蹄疫席卷全球，亚、非、欧三大洲50多个国家相继暴发口蹄疫，多年无疫的英国、韩国、日本等国也发病，给全球畜牧业以沉重打击。仅英国就销毁牛羊450万头(只)，总损失90亿英磅。此次口蹄疫大暴发引起了全世界的震荡和恐慌，联合国粮农组织紧急呼吁世界各国采取“国际紧急行动”对付大流行。目前，国内生物疫苗生产企业培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗时，普遍采用传统的转瓶细胞培养工艺。因为每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差大，隐性污染引起高内毒素，副反应大等缺点。此外细胞密度低、病毒产率低、生产成本高、劳动强度大也是一直困扰从业者的难题。应用动物细胞成规模生产口蹄疫疫苗，是将病毒适应到传代细胞，并在生物反应器上进行大规模的病毒繁殖和培养以实现口蹄疫疫苗的规模化生产，其优点主要是体现在能提高BHK21细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖时的最适生化条件，提高病毒滴度，其次工艺规模放大相对容易，管道化操作最大可能避免了污染的发生，能显著提高口蹄疫疫苗的质量。当前利用动物细胞培养技术生产口蹄疫疫苗中应用最广泛的细胞是BHK21细胞。传统BHK21细胞生产口蹄疫疫苗的过程往往需要使用血清。血清作为细胞生长和维持的重要物质，在细胞培养中发挥重要作用的同时，也带有许多至今无法解决的问题和弊端，如：(1)血清中成分复杂，不能准确加以区分；(2)血清批次间差异很大，且血清的保存期短(不超过1年)，给批次生产的标准化和连续化带来限制；(3)血清中可能携带动物源性病毒、支原体、衣原体等(据统计，20-50％的胎牛血清都是病毒检测阳性的)，从而污染细胞培养过程，使生产的安全性受到质疑；(4)血清蛋白含量极高(蛋白含量超过45g/L)，会给后续目的蛋白的分离纯化带来极大困扰，增大成本。因此，本领域迫切需要开发适于BHK21细胞的无血清培养基。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于BHK21细胞的培养基及相应的培养方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于乳仓鼠肾细胞BHK21的培养基，所述培养基包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、盐类、和活性添加剂，其中，所述必需氨基酸包括谷氨酰胺，并且所述谷氨酰胺的含量为1-100mg/g培养基，或100-2000mg/L培养基(按培养基的总体积计)，和/或谷氨酰胺占全体氨基酸的比例为10-70％(较佳地为5-50％)；并且，所述的活性添加剂包括转铁蛋白、白蛋白和胰岛素，并且所述活性添加剂的总含量为0.1-20mg/g培养基，或10-400mg/L培养基(按培养基的总体积计)。在另一优选例中，所述的必需氨基酸包括选自下组的16-19种氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在另一优选例中，所述的培养基还含有胱氨酸。在另一优选例中，胱氨酸的含量为0.1-5mg/g培养基，或10-70mg/L培养基，优选地为0.4-2.8mg/g培养基，或30-50mg/L培养基。在另一优选例中，所述培养基中，胱氨酸：半胱氨酸的质量比为1：100-100：1，较佳地为1:60-60:1，更佳地为1:20-20:1，最佳地为1:10-10:1。在另一优选例中，所述培养基中，谷氨酰胺的浓度为150-1500mg/L，更佳地为200-800mg/L(按培养基的总体积计)。在另一优选例中，所述精氨酸的浓度为100-200mg/L，较佳地为120-180mg/L，更佳地为140-160mg/L(按培养基的总体积计)。在另一优选例中，所述的活性添加剂中，转铁蛋白、白蛋白和胰岛素的质量比为：1-10：2-40：1-10。在另一优选例中，所述培养基中，所述活性添加剂的总含量为20-200mg/L培养基，较佳地为40-150mg/L培养基。在另一优选例中，所述的培养基还包括脂类、微量元素、蛋白水解物和任选的辅助添加剂。在另一优选例中，所述蛋白水解物为胰蛋白水解物。在另一优选例中，所述蛋白水解物含量为500-6000mg/L，较佳地为1000-5000mg/L，更佳地为2000-4000mg/L(按培养基的总体积计)。在另一优选例中，所述的辅助添加剂包括核酸类物质(如次黄嘌呤、胸苷、或其组合)。在另一优选例中，所述的培养基还含有葡萄糖，其含量为1000-7000mg/L，较佳地为2000-5000mg/L。在另一优选例中，所述的培养基还含有选自下组的成分：缓冲剂、酸碱指示剂、或其组合。在另一优选例中，所述的缓冲剂为缓冲范围(能力)为pH6.0-8.0，较佳地为6.8-7.2的缓冲剂。在另一优选例中，所述缓冲剂选自下组：碳酸氢钠、羟乙基哌嗪乙磺酸、或其组合。在另一优选例中，所述的培养基为液态，或重构为液态时，pH为6.0-8.0，较佳地为6.8-7.2。在另一优选例中，所述维生素选自下组：生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸、或其组合。在另一优选例中，所述盐类选自下组：氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、丙酮酸钠、或其组合。在另一优选例中，所述脂类选自下组：胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温80、嵌段式聚醚F68、或其组合。在另一优选例中，所述微量元素选自下组：Cu、Fe、Zn、或其组合物，较佳地为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、亚硒酸钠、或其组合。在另一优选例中，所述酸碱指示剂为酚红。在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：丙氨酸5-8mg/L，精氨酸100-200mg/L，天冬酰胺20-40mg/L，天冬氨酸10-30mg/L，胱氨酸30-50mg/L，半胱氨酸10-40mg/L，谷氨酸10-20mg/L，甘氨酸5-35mg/L，组氨酸20-70mg/L，异亮氨酸30-80mg/L，亮氨酸35-85mg/L，赖氨酸50-180mg/L，甲硫氨酸15-40mg/L，苯丙氨酸30-50mg/L，脯氨酸5-40mg/L，丝氨酸10-40mg/L，苏氨酸20-80mg/L，色氨酸10-30mg/L，酪氨酸30-80mg/L，缬氨酸30-80mg/L。在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：生物素0.005-0.15mg/L，叶酸4-10mg/L，烟酰胺4-15mg/L，吡哆醇2-7mg/L，硫胺素2-7mg/L，硫辛酸0.4-1.0mg/L。在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：氯化镁30-110mg/L，硫酸镁30-110mg/L，氯化钙150-200mg/L，氯化钾300-500mg/L，氯化钠2000-7000mg/L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于乳仓鼠肾细胞BHK21的培养基，其特征在于，所述培养基包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、盐类、和活性添加剂，其中，所述必需氨基酸包括谷氨酰胺，并且所述谷氨酰胺的含量为1‑100mg/g培养基，或100‑2000mg/L培养基(按培养基的总体积计)，和/或谷氨酰胺占全体氨基酸的比例为10‑70％；并且，所述的活性添加剂包括转铁蛋白、白蛋白和胰岛素，并且所述活性添加剂的总含量为0.1‑20mg/g培养基，或10‑400mg/L培养基(按培养基的总体积计)。

【技术特征摘要】
1.一种用于乳仓鼠肾细胞BHK21的培养基，其特征在于，所述培养基包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、盐类、和活性添加剂，其中，所述必需氨基酸包括谷氨酰胺，并且所述谷氨酰胺的含量为1-100mg/g培养基，或100-2000mg/L培养基(按培养基的总体积计)，和/或谷氨酰胺占全体氨基酸的比例为10-70％；并且，所述的活性添加剂包括转铁蛋白、白蛋白和胰岛素，并且所述活性添加剂的总含量为0.1-20mg/g培养基，或10-400mg/L培养基(按培养基的总体积计)。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的必需氨基酸包括选自下组的16-19种氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，谷氨酰胺的浓度为150-1500mg/L，更佳地为200-800mg/L(按培养基的总体积计)。4.如权利要求1所述的培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭文松，刘旭平，
申请(专利权)人：上海倍谙基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31