适合无血清全悬浮培养的BHK细胞及其驯化方法技术

本发明专利技术提供了一种适合无血清全悬浮培养的BHK细胞及其驯化方法。具体地，本发明专利技术提供了一种高效而快速对BHK细胞进行驯化，从而获得适用于无血清全悬浮培养的BHK细胞的方法，以及经驯化BHK细胞及其应用。该驯化方法在无逐步降血清的情况下快速而高效地制得非常适合无血清悬浮培养的BHK细胞，驯化时间短、操作简单、成本低，细胞在转变为悬浮生长过程中形态和特性不易发生转变，成功率高，是一种稳定通用的BHK细胞无血清悬浮驯化的方法。本发明专利技术方法制备的BHK细胞生长状态稳定，对口蹄疫病毒的敏感性高，细胞分散，生长快，活细胞密度可达1.1×10

【技术实现步骤摘要】
适合无血清全悬浮培养的BHK细胞及其驯化方法
本专利技术属于生物
，具体地涉及一种适合无血清全悬浮培养的BHK细胞及其驯化方法。
技术介绍
BHK细胞是叙利亚仓鼠肾细胞，其连续传代能力强，且对口蹄疫病毒(FMDV)较为敏感，适合口蹄疫病毒在其细胞内增殖，自从20世纪六七十年代起被广泛用于口蹄疫病毒疫苗的生产。我国从20世纪80年代初开始使用有血清培养基转瓶培养贴壁的BHK细胞进行口蹄疫病毒灭活疫苗的生产，然而存在副反应大、成本高、产量低、后期分离纯化困难、质量稳定性差等问题。为了解决上述有血清培养带来的诸多不利因素，推进以BHK细胞无血清高密度全悬浮培养生产口蹄疫病毒灭活疫苗的新工艺开发，成为口蹄疫疫苗制造行业的迫切希望。由于BHK原始细胞株为成纤维细胞，为贴壁依赖型培养株，贴壁特性较强，并且通常在培养过程中需添加动物血清才能正常生长，所以对其的无血清悬浮驯化过程较为复杂和困难。而目前已有的BHK悬浮细胞无代次控制、稳定性较差，且细胞密度难以突破1千万，对口蹄疫病毒的敏感性降低，尤其是无血清悬浮培养后上述问题更为突出，且细胞在长期使用过程中易出现结团、细胞形态变差等现象。因此，各企业和科研单位不得不根据各自的科研生产目的，在项目过程中自行对BHK细胞多次进行无血清驯化。针对上述情况，一项稳定通用的对BHK贴壁细胞进行无血清悬浮驯化的方法极具指导价值。贴壁细胞的悬浮驯化是将从方瓶中消化下来的贴壁细胞进行低转速离心并用新鲜培养基连续传代培养的过程。而在目前已有的BHK无血清悬浮驯化方法中，一般都将经历从贴壁培养到低血清贴壁培养、再到低血清悬浮培养，直至最后得到无血清悬浮培养的BHK细胞。其中从方瓶的贴壁培养到摇瓶的悬浮培养通常都涉及到逐步降血清的步骤，使得整个驯化过程的实验步骤变得复杂、操作要求高，并且细胞结团严重、生长缓慢、密度低。整个驯化过程通常耗时较久，从而增加了更多不确定因素，成功率低，且细胞在逐渐适应由贴壁生长转变为悬浮生长的过程中形态和特性都将发生转变。此外，BHK细胞在悬浮传代过程中可能因表面与FMDV感染相关的受体丢失或表达量下降而丧失对FMDV的敏感性。驯化时间越长，细胞代次越高，细胞特性转变和敏感性降低的可能性就越大，尤其是BHK细胞。因此，本领域迫切需要一种高效而快速对BHK细胞进行驯化，从而获得适用于无血清全悬浮培养的BHK细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高效而快速对BHK细胞进行驯化，从而获得适用于无血清全悬浮培养的BHK细胞的方法，以及经驯化BHK细胞及其应用。本专利技术的第一方面，提供了一种对BHK细胞进行驯化的方法，所述方法包括步骤：(a)提供一待驯化的BHK细胞，所述的BHK细胞为贴壁培养型BHK细胞；(b)将所述待驯化的BHK细胞作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得经驯化培养的BHK细胞；和(c)将上一步骤获得的经驯化培养的BHK作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得进一步驯化培养的BHK细胞，其中该步骤(c)重复n次，n为5-50的正整数，直至所获得的经驯化培养的BHK细胞为悬浮培养型BHK细胞；其中，在步骤(b)和(c)中，所述无血清培养基含有以下成分：(1)谷氨酰胺，浓度为2000-4000uM；(2)维生素VB12，浓度为1-2uM；(3)乙醇胺，浓度30-50uM；和(4)硒元素，浓度为0.05-0.2uM。在另一优选例中，所述的无血清培养基中，血清含量为≤0.1％(v/v)，较佳地≤0.01％(v/v)，更佳地为0％(v/v)。在另一优选例中，所述的n为10-30、15-30、20-30、20-40、或15-45。在另一优选例中，在步骤(b)和(c)中，各无血清培养基是相同或不同的培养基。在另一优选例中，在步骤(b)和(c)中，各无血清培养基是主要成分基本相同的培养基。在另一优选例中，所述的主要成分包括：碳源、氮源、和无机盐等。在另一优选例中，所述的无血清培养基为基础培养基、无蛋白培养基、或化学成分确定的培养基。在另一优选例中，所述的培养基中，硒元素来自有机化合物或无机化合物，较佳地来自亚硒酸或亚硒酸盐(如亚硒酸钠)。在另一优选例中，在所述方法中，随着n的增大，硒元素的浓度是逐渐下降或不变的。在另一优选例中，所述的悬浮培养型BHK细胞是在无血清条件下的悬浮培养型BHK细胞。在另一优选例中，所述的悬浮培养型BHK细胞是在无血清条件下≥95％(如95-100％，或98-99％)细胞处于悬浮培养状态。在另一优选例中，所述的悬浮培养型BHK细胞具有选自下组的一个或多个特征：(i)细胞呈分散状；(ii)细胞呈圆润、透亮状；(iii)细胞生长状态稳定；(iv)适合高密度悬浮培养。在另一优选例中，所述的高密度指5×106-5×107细胞/ml(或更高)。在另一优选例中，在步骤(b)的驯化培养过程中，包括：对种子细胞进行消化处理，然后将所述经消化的种子细胞接种于所述的无血清培养基。在另一优选例中，在步骤(c)的一个或多个或全部的驯化培养中，包括对种子细胞进行消化处理，然后将所述经消化的种子细胞接种于所述的无血清培养基。在另一优选例中，所述的消化处理在步骤(c)中当n≤20(较佳地n≤10)时进行。在另一优选例中，所述消化处理中的处理条件包括：添加胰蛋白酶。在另一优选例中，所述消化处理中的处理条件包括：添加胰蛋白酶后放置于36-38℃、4-6％CO2和转速为200-250转/分钟培养箱中。在另一优选例中，所述胰蛋白酶的用量为0.05％-1％，较佳地为0.1％-0.5％，更佳地为0.2％-0.3％，按混合物(或培养体系)的总重量计。在另一优选例中，在驯化培养24h-48h后进行消化处理。在另一优选例中，所述消化处理的时间为5-15min，较佳地为10min。在另一优选例中，所述的消化处理后还包括：加入胰酶抑制剂或血清培养基停止消化。在另一优选例中，在步骤(b)和(c)中，所述BHK细胞在带透气盖尖底离心培养反应管中进行培养。在另一优选例中，所述各驯化培养包括：在36-38℃、4-6％CO2和转速为200-250转/分钟下进行培养。在另一优选例中，所述各驯化培养包括：种子细胞的接种量为1×105-1×106细胞/ml，较佳地为4×105-1×106细胞/ml，更佳地为5×105-1×106细胞/ml。在另一优选例中，所述各驯化培养包括：培养体积为15-25ml，较佳地为20ml。在另一优选例中，所述各驯化培养包括：培养时间为1-3天，优选为1-2天。在另一优选例中，在步骤(c)中，还包括：对所述的经进一步驯化培养的BHK细胞进行分选处理，从而去除细胞团并获得悬浮的BHK细胞，并将所述悬浮的BHK细胞用作下一驯化培养的种子细胞。在另一优选例中，所述的分选处理是在n≥5(较佳地n≥10)时进行。在另一优选例中，在步骤(c)中，所述的消化步骤和分选处理可以先后、交替、或同时进行。在另一优选例中，所述步骤(b)和步骤(c)的总时间为20-40天。在另一优选例中，提供一待驯化的BHK细胞包括：于含10％血清的DMEM培养基中复苏所述BHK细胞。在另一优选例中，提供一待驯化的BHK细胞包括：将所述BHK细胞接种于血清培养中进行贴壁培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对BHK细胞进行驯化的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(a)提供一待驯化的BHK细胞，所述的BHK细胞为贴壁培养型BHK细胞；(b)将所述待驯化的BHK细胞作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得经驯化培养的BHK细胞；和(c)将上一步骤获得的经驯化培养的BHK作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得进一步驯化培养的BHK细胞，其中该步骤(c)重复n次，n为5‑50的正整数，直至所获得的经驯化培养的BHK细胞为悬浮培养型BHK细胞；其中，在步骤(b)和(c)中，所述无血清培养基含有以下成分：(1)谷氨酰胺，浓度为2000‑4000uM；(2)维生素VB12，浓度为1‑2uM；(3)乙醇胺，浓度30‑50uM；和(4)硒元素，浓度为0.05‑0.2uM。

【技术特征摘要】
1.一种对BHK细胞进行驯化的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(a)提供一待驯化的BHK细胞，所述的BHK细胞为贴壁培养型BHK细胞；(b)将所述待驯化的BHK细胞作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得经驯化培养的BHK细胞；和(c)将上一步骤获得的经驯化培养的BHK作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得进一步驯化培养的BHK细胞，其中该步骤(c)重复n次，n为5-50的正整数，直至所获得的经驯化培养的BHK细胞为悬浮培养型BHK细胞；其中，在步骤(b)和(c)中，所述无血清培养基含有以下成分：(1)谷氨酰胺，浓度为2000-4000uM；(2)维生素VB12，浓度为1-2uM；(3)乙醇胺，浓度30-50uM；和(4)硒元素，浓度为0.05-0.2uM。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的悬浮培养型BHK细胞具有选自下组的一个或多个特征：(i)细胞呈分散状；(ii)细胞呈圆润、透亮状；(iii)细胞生长状态稳定；(iv)适合高密度悬浮培养。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)的一个或多个或全部的驯化培养中，包括对种子细胞进行消化处理，然后将所述经消化的种子细胞接种于所...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭文松，王楠，李敏捷，叶倩，赵亮，刘旭平，范里，
申请(专利权)人：上海倍谙基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31