用于检测CpG甲基化和诊断癌症的方法技术

本发明专利技术涉及药物基因组学领域，并且特别地涉及检测高甲基化DNA的存在或不存在。DNA标记中CpG甲基化的检测可用于癌症的诊断，并且本发明专利技术为此提供了改进的方法。这些改进的方法特别地允许在未甲基化DNA标记的高背景下更灵敏地检测甲基化DNA标记。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测CpG甲基化和诊断癌症的方法
本专利技术涉及药物基因组学领域，并且特别地涉及检测高甲基化DNA的存在或不存在.DNA标记中CpG甲基化的检测可用于癌症和癌症亚型的诊断，并且本专利技术为此提供了改进的方法.这些改进的方法特别地允许在未甲基化DNA标记的高背景下更灵敏地检测甲基化DNA标记.
技术介绍
超过65年前，Mandel和Metais首次描述了在人中存在细胞外核酸的观察结果(MandelP，MetaisP.Lesacidesnucleiquesduplasmasanguinchezl′homme.C.R.Acad.Sci.Paris142，241-243.1948)，并且在四十多年后，可以明确证明，在从血浆、血清和其他体液分离的无细胞核酸中可以发现肿瘤相关的遗传改变(FleischhackerM，SchmidtB.(2007)Circulatingnucleicacids(CNAs)andcancer--asurvey.BiochimBiophysActa1775：181-232；JungK，FleischhackerM，RabienA.(2010)Cell-freeDNAinthebloodasasolidtumorbiomarker-acriticalappraisaloftheliterature.ClinChimActa411：1611-1624).这包括在不同形式的恶性肿瘤中观察到的表观遗传改变.DNA甲基化是哺乳动物染色质的标志，并且已知在CpG二核苷酸背景下的胞嘧啶甲基化在调节发育中发挥作用并且在例如胚胎发生和细胞分化的基本生物学过程具有重要意义(SmithZD，MeissnerA.(2013)DNAmethylation：rolesinmammaliandevelopment.NatRevGenet14：204-220；GibneyER，NolanCM.(2010)Epigeneticsandgeneexpression.Heredity(Edinb)105：4-13).因此，甲基化不仅调节基因转录，而且还在维持基因组稳定性、印记(imprinting)和X染色体失活中起重要作用.癌基因和肿瘤抑制基因中的表观遗传改变在癌症发生中具有关键的重要性(SuvaML，RiggiN，BernsteinBE.(2013)Epigeneticreprogrammingincancer.Science339：1567-1570)。DNA甲基化模式在癌细胞中极大改变，因此可用于区分癌细胞与正常组织。因此，DNA甲基化模式被用于诊断所有类型的癌症。比较近的理念是使用从肿瘤释放到例如血液的游离循环肿瘤DNA进行甲基化分析，作为患者体内肿瘤负荷的指示.这种用非常灵敏且高度特异性的方法从肿瘤患者分离并表征细胞外核酸的能力导致产生术语“液体活检”.因此，医生不再仅依赖于组织活检和全身扫描的单一检查.在这样的液体活检中，在未甲基化非肿瘤DNA的高背景下检测少量的甲基化肿瘤DNA极大地挑战了该检测方法的灵敏度.而使用基于在重亚硫酸盐转化(bisulfiteconversion)后选择性地扩增甲基化肿瘤DNA的技术(例如甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR，MSP)，尤其是HeavyMethylTM(HM)技术)已取得了非常好的结果(Cottrell等，Areal-timePCRassayforDNA-methylationusingmethylation-specificblockers.NucleicAcidsRes.2004年1月13日；32(1)：e10).癌症越早期，治疗选择和治愈患者的机会就越好.因此，非常期望尽可能早地诊断癌症.然而，较早期癌症(其意味着肿瘤尺寸较小且癌细胞较少)释放较少的游离循环肿瘤DNA.这由于以下事实而加剧：细胞外核酸的半衰期相当短，例如在血浆中短于6小时(RagoC，HusoDL，DiehlF，KarimB，LiuG等.(2007)SerialassessmentofhumantumorburdensinmicebytheanalysisofcirculatingDNA.CancerRes67：9364-9370).因此，检测方法越灵敏，则可以越早地可靠诊断或完全诊断癌症.由此，本领域需要以提高的灵敏度检测DNA甲基化的方法.对于灵敏检测，HeavyMethylTM或HM(引物甲基化非特异性地结合，但是被甲基化特异性地阻断，并且因此当在之前的扩增循环中未能阻断时，即使不想要的模板以最小水平产生，也将重新阻断)被认为是与MSP(其特异性地引发甲基化，因此在发生错误引发(mispriming)的情况下仍引入完全匹配模板，所述模板然后以指数方式扩增)相比而言的首选.HM的优点似乎要与一个缺点进行权衡：广泛接受的理论是，针对该阻断剂的富含CpG的部分需要与没有CpG的引发位点并排。这极大地限制了待分析位点或区域的选择，因为在给定的靶DNA中只有这么多合适的位点或区域.由于设计限制(不期望的CpG位点、SNP等)，用于HM的甲基化测定在过去使用大小长至150bp的扩增子，本专利技术人认为HM普遍也适于处理循环肿瘤DNA中的DNA片段化.多年的经验和结果比较向本专利技术人显示，这样长度的癌症标记测定在含有癌细胞的样品中非常有用(全尺寸高分子量基因组肿瘤DNA)，并且当应用于其中靶标是游离循环DNA(预期这样的DNA是至少部分片段化的)的液体活组织/体液时也有用。专利技术人现在已经发现：出乎意料地，进一步减小扩增产物(amplificate)的尺寸导致远远更好的扩增(在循环肿瘤DNA中发现甚至不依赖于DNA片段化)，给出显著改善的信号：这在未甲基化非肿瘤DNA的高背景下其原始模板(即，甲基化肿瘤DNA)稀少时尤其有用.据本专利技术人所知，将减小扩增子尺寸作为主要设计目标而不关注其他问题(例如，不期望的CpG位点、SNP等)的研究之前尚未进行，因为小尺寸极大地限制了待分析位点或区域的选择：由于存在可能被引物覆盖的CpG位点，所述引物对于使用HeavyMethylTM的灵敏检测必须是甲基化非特异性的，因此合适的位点或区域更少.此外，SNP位点不应被引物覆盖，因为如果引物对SNP的特定核苷酸是特异性的，则会使灵敏度偏倚.本专利技术人还出乎意料地发现，在HM引物中的CpG位点(或SNP位点)中引入错配(对于CpG位点中的胞嘧啶位置，通过引入例如以下错配来实现甲基化非特异性：C＝C、T＝C、C＝T或T＝T错配，其中第一碱基在引物中，第二碱基在重亚硫酸盐DNA有义模板中，或者A＝G、G＝G、A＝A或G＝A错配，其中第一碱基在引物中，第二碱基在重亚硫酸盐合成反向互补链中)并不会引入较差的阻断或非特异性引发，即使错配位置位于引物中间(并且不限于预期负面影响较小的邻近引物5’端的位置)也是如此，而不仅是在通过设计(例如延伸)调节整体引物结合焓(enthalpy)时.事实上，有证据表明这样的构建体甚至可被更好地阻断.本专利技术人认为，这可能是因为被阻断引物的不稳定性与仍良好退火的未阻断引物相比甚至更高.根据这些发现调整的用于检测癌症的方法将通过提供最有希望的治疗时间窗的可能性来改善癌症患本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，所述方法包括以下步骤：(a)将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；(b)使用甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂来扩增转化的靶DNA的区域，其中所述区域的长度小于100个碱基对(bp)并且包含所述基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点；以及(c)检测步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在，其中扩增的DNA的存在或不存在分别反映所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.19 EP 14199447.51.一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中所述基因组DNA是至少部分片段化的，所述方法包括以下步骤：(a)将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；(b)使用甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂来扩增转化的靶DNA的区域，其中所述区域的长度小于100个碱基对(bp)并且包含所述基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点；以及(c)检测步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在，其中扩增的DNA的存在或不存在分别反映所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物。3.一种用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其包括以下步骤：(a)将DNA中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；(b)使用甲基化非特异性引物寡核苷酸和至少一种以甲基化特异性方式阻断扩增的甲基化特异性阻断剂来扩增转化的靶DNA的区域，其中所述区域包含所述基因组DNA的至少3个不被引物覆盖的CpG位点，其中至少一种引物寡核苷酸：(1)覆盖至少一个CpG位点，其具有与CpG位点的胞嘧啶碱基位置相关的甲基化非特异性错配或间隔物，和/或(2)覆盖至少一个SNP位点，其具有SNP非特异性错配或间隔物；以及(c)检测步骤(b)中扩增的DNA的存在或不存在，其中扩增的DNA的存在或不存在分别反映所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述区域的长度小于100个碱基对(bp)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述靶DNA是基因组人FOXL2、SHOX2或PTGER4DNA，包括各自的启动子区以及其上游和下游5kb内的DNA。6.一种用于在对象中检测癌症的存在或不存在的方法，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的用于在包含基因组DNA的样品中检测高甲基化靶DNA的存在或不存在的方法，其中：-所述样品是来源于对象的样品，在患有所述癌症的对象中其包含癌细胞的肿瘤DNA，-所述靶DNA在患有所述癌症的患者的癌细胞中是高甲基化的，并且-所述样品中高甲基化靶DNA的存在或不存在分别指示所述对象中所述癌症的存在或不存在。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌症是肺癌或结肠直肠癌。8.一种甲基化非...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼斯·科特维茨，约恩·莱温，安妮·施莱格尔，雷莫·特茨纳，
申请(专利权)人：表观基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE