本发明专利技术涉及分析基因组的三维结构领域，即，用于基因组结构绘图(GAM)。本发明专利技术提供一种确定在隔室(诸如细胞核)中多个核酸基因座的空间接近性的方法，其通过利用隔室的各级分中它们的共分离，所述级分在根据隔室中它们的定位（例如，通过低温切片或低温研磨隔室）将核酸基因座彼此分离以得到级分群时鉴定；确定在所述级分中存在或不存在多个基因座；和确定所述多个基因座的共分离。可随后使用统计方法来分析共分离，以确定空间接近性。所述方法可例如用于确定多个基因座之间的物理距离；和例如在核中绘图基因座和/或基因组结构；鉴定通过空间接触指导特定基因表达的可调节区域；鉴定在核中外源核酸的核位置和/或诊断与基因座的被干扰的共分离相关的疾病。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因组结构绘图本专利技术涉及分析基因组的三维结构领域，即，用于基因组结构绘图(GAM)。本专利技术提供一种确定在隔室(诸如细胞核)中多个核酸基因座的空间接近性的方法，在该隔室的各级分中，其通过利用隔室的各级分中它们的共分离，所述级分在根据隔室中它们的定位(例如，通过低温切片或低温研磨隔室)将核酸基因座彼此分离以得到级分群时鉴定；确定在所述级分中存在或不存在多个基因座；和确定所述多个基因座的共分离。可随后使用统计方法来分析共分离，以确定空间接近性。所述方法可例如用于确定多个基因座之间的物理距离；和例如在核中绘图基因座和/或基因组结构；鉴定通过空间接触指导特定基因表达的可调节区域；鉴定在核中外源核酸的核位置；鉴定染色质压实和/或诊断与基因座的被干扰的共分离相关的疾病。已采用若干方法来分析基因组的结构和染色质相互作用。线性基因组距离通常通过测序(例如鸟枪法测序)来分析。在基因组(特别是，在重复序列的情况下)中，可例如通过HAPPY绘图1来解决定位序列的问题，其基于在基因组DNA的随机碎裂和稀释后基因座共分离的频率，测量基因座之间的线性基因组距离，并且可用于高达约200kb线性距离。关于染色质的三维结构的信息也是高度受关注的，特别是，以发现可调节区域和基因启动子之间的接触。染色体相互作用影响基因表达的一个实例为可折叠的染色体区域，以便在基因的密切接近性内，带来增强剂和关联的转录因子。研究染色体的结构性质和空间组织对于基因表达的调节、DNA复制和修复以及重组的理解和评价是重要的。例如，在癌症或先天性疾病中，染色体的折叠和它们的接触对于疾病机理和阐明治疗方法的目标具有重要的暗示。染色质以相互作用和非相互作用状态存在。相互作用状态具有不同的性质，其取决于在相互作用中涉及的结合位点的特性，即，(a)它们的数量、距离和分配，(b)它们对粘合剂的特异性和亲和力，和(c)粘合剂的浓度和特异性。染色质相互作用还可涉及同时关联的不同数量的基因座(相互作用的多样性)。荧光性原位杂化(FISH)利用显微术来直接测量基因组基因座之间的空间距离，但是其可仅适用于在同一核中一次研究少量的基因组区域(例如，PomboA.2003.Cellulargenomics：whichgenesaretranscribedwhenandwhere？TrendsBiochem.Sci.28，6)。理论上有可能使用不同组的探头来再次探测相同的细胞或组织切片，但是得注意重复的再次探测引起结构假象，例如，由于分离随后的探头组所需的DNA变性，例如，诱导基因座的人工聚集(接触)(即，相对于彼此和相对于核界标(例如，核薄层)，亚基因组区域的再次定位)。在中期染色体的情况下，其代表更加浓缩的(并且预期更加稳定的)染色质，再次探测可重复最多六次(PauciulloA等人，2014，Developmentofasequentialmulticolor-FISHapproachwith13chromosome-specificpaintingprobesfortherapididentificationofriverbuffalo(使用13种染色体-特异性涂漆探头，开发连续多色-FISH方法，用于快速鉴定riverbuffalo)(Bubalusbubalis，2n＝50)chromosomes.JApplGenet.55(3)：397-401)，但是在第二次探测后，关于染色体形态的降解的关注可能已经显而易见，这可导致损失染色体或核(Heslop-HarrisonJS，HarrisonGE，LeitchIJ(1992)ReprobingofDNA：DNAinsituhybridizationpreparations(DNA的再探测：DNA原位杂化制备)。TrendsGenet8：372-373)。RNA-FISH为较温和的FISH方法，其不涉及DNA变性，但是可能仅用于确定主动转录的基因(非沉默基因)的核位置。来自在细胞周期的相间阶段(其中最通常绘图官能的染色质接触)中细胞的样品可被再次探测用于RNA-FISH仅约三次，但是已经不能详细测量结构的保护。可同时施用于DNA-或RNA-FISH的探头数量受到可识别荧光标记物的限制，例如，通过组合五种颜色、四种颜色比率和两种不同水平的强度，原则上可得到181种条形码(PomboA.2003.Cellulargenomics：whichgenesaretranscribedwhenandwhere？TrendsBiochem.Sci.28，6)。然而，当分析的基因座在空间上如此接近，以至于在一个探头中荧色物的组合不能与组合中的另一个区别时，该方法(多路复用荧色物)失败，因此并不顺从在空间上接近的基因座的鉴定。此外，由于每一个特定的基因座需要标记的探头，FISH可仅适用于分析关注的已知基因座的相互作用，并且例如在检测内源或外源DNA序列中失败，除非它们已知为先验，例如，外源DNA的精确序列和病毒亚型整体位置(viralsubtypeintegrationposition)。线性基因组组织的先验假定也使FISH混乱，其不可接受用于研究染色质定位特性，例如，染色质接触，当例如关注在有机体群体中基因组序列的天然变体的影响时，例如，在研究人样品中，由于FISH不会内在地检测序列变化(诸如拷贝数量变化或基因组重排)的事实，而没有样品的先验探头设计或先验整个基因组测序接着探头设计。在不同的方法，指定的INGRID(相互作用DNA碎片的IN-Gel复制；Gavrilov，A.A等人，2014，Quantitativeanalysisofgenomicelementinteractionsbymolecularcolonytechnique(通过分子克隆技术，基因组要素相互作用的定量分析)。Nucl.AcidsRes.42(5)：e36)，交联的染色质碎片在大面积的聚丙烯酰胺凝胶层上铺展，接着使分别以在所选的DNA碎片的凝胶内扩增期间产生的单组分和多组分分子群体形式的单独的和关联的要素可视化，其通过分子标志技术显现(ChetverinAB，ChetverinaHV.Molecularcolonytechnique：anewtoolforbiomedicalresearchandclinicalpractice(分子群体技术：用于生物化学研究和临床实践的新的工具)。Prog.NucleicAcidRes.Mol.Biol.2008；82：219-255)。该技术还依赖于基因组组织的先验知识，并且不能内在地发现DNA序列变化、其空间组织以及其如何影响整个基因组的空间组织。分析基因组的三维结构的备选的当前的方法主要基于染色体构型捕获(3C)技术，其中存在许多当前的版本和改编(图4)。基于3C的方法通常由介导基因组接触的蛋白质的弱化学交联开始。在染色质提取后，DNA的交联的块使用用于DNA碎裂的限制酶处理。加入连接酶，随后连接(连接)两块DNA。3C的不同的变化使用检测这样的连接事件的不同的方法：流行的一种方法是测序(Hi-C，4C-seq)。对这些技术的限制在图4中描述，并且已经在文献中讨论过(例如，在BelmontA.S.，2014中。Lar本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种确定在隔室中多个核酸基因座的空间接近性的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 根据在隔室中它们的定位，通过低温切片或低温研磨所述隔室，以得到级分群，优选，通过低温切片，使核酸基因座彼此分离；(b) 确定在所述级分中存在或不存在多个基因座；和(c) 确定所述多个基因座的共分离。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.11 EP 14197405.51.一种确定在隔室中多个核酸基因座的空间接近性的方法，所述方法包括以下步骤：(a)根据在隔室中它们的定位，通过低温切片或低温研磨所述隔室，以得到级分群，优选，通过低温切片，使核酸基因座彼此分离；(b)确定在所述级分中存在或不存在多个基因座；和(c)确定所述多个基因座的共分离。2.权利要求1的方法，其中所述核酸为DNA和/或RNA，优选，DNA。3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述隔室为真核细胞、线粒体或原核细胞的核。4.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(a)在与甲醛交联之前。5.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(a)中的所述分离通过超低温切片所述隔室进行。6.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(a)中，将一个隔室分隔成为约5-300个级分，优选，约40-60个级分。7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述级分群包含多于180个级分。8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述级分群由多个隔室得到。9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多个基因座为在所述隔室中两个基因座至所有核酸基因座。10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法允许检测至少三个共分离基因座。11.前述权利要求中任一项的方法，其中使用非显微镜方法确定存在或不存在所述多个基因座。12.前述权利要求中任一项的方法，其中通过测序，优选，通过下一代测序，确定存在或不存在多个基因座。13.前述权利要求中任一项的方法，其中通过使用选自推理统计方法的统计方法来分析共分离，确定空间接近性，其中当它们以高于由在染色体上它们的线性基因组距离预期的频率共分离时，优选确定基因座...
【专利技术属性】
技术研发人员：A庞博，P爱德华兹，M尼科德米，A夏尔多内，R比格里，
申请(专利权)人：马克思德布鲁克分子医学中心亥姆霍兹联合会，
类型：发明
国别省市：德国,DE
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