一种检测多种动物源性成分的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测多种动物源成分的试剂盒，包括膜芯片，所述膜芯片由支持膜和固定于支持膜上的探针组成；所述探针为检测猪、羊、牦牛、驴和鼠的特异性探针，其序列如Seq No.1‑5所示，各探针的5’端带有氨基标记；试剂盒还包括检测内参基因的内参探针、阳性探针和阴性探针的膜芯片，其序列如Seq No.6‑8所示，各探针的5’端带有氨基标记；以及5’端带生物素标记的阳性寡核苷酸单链DNA，其序列如Seq No.9所示。本发明专利技术的试剂盒能够一次性大量地对不同种类肉制品中是否含有猪、羊、驴、牦牛、鼠等5种动物源性成分进行检测；获得的检测结果具有特异强、灵敏度高、假阳性率低、可视化程度高以及成本低等特点。

A kit and detection method for detecting various animal source components

The present invention provides a kit for detection of animal derived components, including film chip, the chip is supported by membrane and membrane probe fixed on the support membrane component; the probe for the detection of specific probes of pigs and sheep, yak, and rats, the sequence of Seq No.1 5 shows each probe, 5 'end labeled with amino; membrane chip kit also includes a reference probe, detection of reference genes positive and negative probe probe, the sequence of Seq No.6 8 shows, each probe on the 5' end labeled with amino; and 5 'end with biotinylated oligonucleotide positive single stranded DNA, its sequence is shown as Seq No.9. The kit of the invention can be disposable large for different kinds of meat products containing pigs, sheep, donkeys, yak and rat were detected in 5 kinds of animal derived ingredients; the detection results obtained with specific strength, high sensitivity, low false positive rate and a high degree of visualization and low cost characteristics.

【技术实现步骤摘要】
一种检测多种动物源性成分的试剂盒及检测方法
本专利技术属于检测用品
，尤其涉及一种检测多种动物源性成分的试剂盒及检测方法。
技术介绍
近年来，我国食品业进入了飞速发展的黄金时期，禽畜类肉制品及其制品丰富了广大人民群众的餐桌，然而肉制品屡屡出现掺假掺杂现象。狐狸肉、鸭肉冒充羊肉，牛肉汉堡肉饼掺马肉等事件层出不穷，肉制品掺伪造假也成为食品安全监管领域的热点和难点。随着现代肉类产品工业的发展，为了权衡肉制品口味、生产加工成本效益等因素，市场上越来越多的肉制品由多种类动物源性的肉加工制成，同一份样品往往需要同时开展多种动物源性成分的检测。我国现行食品动物源性成分检测标准，都是利用PCR技术、实时荧光PCR技术开展动物源性成分目标基因的检测，这些技术每次仅能检测1至3种动物源性指标，无法满足3种以上动物源性成分的同时检测。现有检测方法对操作人员技术、实验室仪器设备配置要求较高，检测成本昂贵，很难满足批量大、高效快速的检验要求，无法满足市场监管、企业原料及成品质量实时控制的迫切需求。
技术实现思路
针对目前同时检测多种动物源成分的检测成本昂贵等问题，本专利技术提供一种检测多种动物源性成分的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测多种动物源成分的试剂盒，包括膜芯片，所述膜芯片由支持膜和固定于支持膜上的探针组成；所述探针为检测猪、羊、牦牛、驴和鼠的特异性探针，内参探针，阳性探针和阴性探针，其序列如SeqNo.1-8所示，各探针的5’端带有氨基标记。所述猪、羊、牦牛、驴和鼠的特异性探针与各成分的线粒体基因结合。可选地，支持膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚丙烯膜；最优选为尼龙膜。作为优化，上述试剂盒还包括检测内参基因的内参探针、阳性探针和阴性探针的膜芯片，其序列如SeqNo.6-8所示，各探针的5’端带有氨基标记。内参探针检测18SrRNA基因。更为优化地，上述试剂盒还包括5’端带生物素标记的阳性寡核苷酸单链DNA，其序列如SeqNo.9所示。阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性探针特异性结合，用于实验过程中的质量控制。作为优化，上述试剂盒还包括碱性磷酸酶标记链霉亲和素，底物显色液，去活化液，杂交液，酶孵育液。所述底物显色液包含0.15mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP），0.30mg/mL氯化硝基四氮唑兰（NBT），5mmol/LMgCl2和100mmol/LTris-HCl，其pH为9.5，其中底物为BCIP和NBT。所述去活化液含100mmol/LNaOH；杂交液含2×SSPE和0.1wt%十二烷基硫酸钠（SDS）；酶孵育液含2×SSPE，0.5wt%SDS；酶孵育洗液为2×SSPE，所述2×SSPE缓冲液包含0.3mol/LNaCl，20mmol/LNaH2PO4，20mmol/LEDTA·Na2，其pH为7.4。可选地，上述试剂盒还包括猪、羊、牦牛、驴和小鼠成分的扩增引物对和内参扩增引物对，其序列如SeqNo.10-21所示；所述扩增引物对中反向引物的5'端带有生物素标记。可选地，试剂盒还包括辅料，所述辅料包括脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP），尿嘧啶DNA糖基酶（UNG酶），DNA聚合酶（Taq酶）和10×PCR缓冲液。所述10×PCR缓冲液含15mmol/LMgCl2，100mmol/LTris-HCl，500mmol/LKCl，其pH为8.0-8.3。上述试剂盒检测肉制品中猪、羊、驴、牦牛、鼠源性成分的最低检测限为0.1wt%。采用上述试剂盒检测多种动物源成分的方法，包括以下步骤：（1）提取样品中DNA；（2）以步骤（1）中DNA为模板进行多重PCR；（3）将步骤（2）中PCR产物与试剂盒中的膜芯片杂交并显色；（4）对结果进行判断：a）空白对照：PC显色，其余靶点无信号检出；b）阴性对照：PC显色，内参有信号检出；c）阳性对照：PC显色，内参有信号检出，靶点有信号检出；同时满足以上三个条件的为有效实验，根据显色结果判断所含动物源性成分。上述步骤（2）中DNA溶液的OD260/280值为1.7-1.9。上述步骤（3）中杂交步骤包括去活化，杂交，酶孵育操作。本专利技术具有以下优点：本专利技术的动物源成分检测试剂盒通过提供多种引物对的组合进行多重PCR扩增的同时进行非对称PCR扩增技术（AsymmetricPCR）用以提高检测灵敏度。非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的正向引物和反向引物（或是扩增延伸条件不同的正向引物和反向引物），PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的探针杂交，从而提高检测灵敏度。本专利技术提供的动物源性成分检测试剂盒通过5’端带有生物素标记序列的反向引物或正向引物结合到模板上并延伸扩增得到大量的5’端带有生物素标记的单链DNA，该5’端带有生物素标记的单链DNA通过碱基互补原则对应地与探针杂交，经显色处理后，显示出相应颜色，进而得到检测结果。阳性探针和阴性探针可用于评判显色结果的可靠性。杂交前通过碱的作用去除膜芯片上没有反应的羟基，减少背景对探针吸附，减少背景干扰。本专利技术获得的检测结果具有特异强、灵敏度高、假阳性率低、可视化程度高以及成本低等特点。附图说明图1为膜芯片探针布局示意图；图2为猪、羊、牦牛、驴、鼠5种动物源性成分检测结果；图3为16种干扰动物源性成分检测结果；图4为检验猪、羊、驴、牦牛、鼠成分灵敏度验证结果；图5为动物源性成分掺假灵敏度验证。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1试剂盒制备1.1膜芯片制备将如SeqNo.1-8所示的猪、羊、牦牛、驴、鼠五种探针及阳性探针、阴性探针和内参探针以超纯水配制成浓度为25μmol/L的溶液，采用微定量喷点式膜芯片点样仪，将各个核苷酸探针分布在带负电荷尼龙膜芯片上的特定位置区域，芯片表面包被的探针布局如图1所示，其中，PC为阳性探针，NC为阴性探针。1.2试剂配制配制10×PCR缓冲液（P1），含15mmol/LMgCl2，100mmol/LTris-HCl，500mmol/LKCl，其pH为8.3。将如SeqNo.10-21所示的猪、羊、牦牛、驴、鼠的扩增引物对和内参扩增引物对配制成多重PCR引物预混液（P2），其中每条引物浓度为2µmol/L。配制多重PCR预混液（P3）：dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP各0.4mmol/L，尿嘧啶DNA糖基酶（UNG酶）0.2U/μL，DNA聚合酶（Taq酶）0.4U/μL。将阳性寡核苷酸单链DNA配制为10µLmol/L的溶液（PC）。配制去活化液（H1），含100mmol/LNaOH。配制2×SSPE缓冲液（H4），含0.3mol/LNaCl，20mmol/LNaH2PO4，20mmol/LEDTA·Na2，其pH为7.4。配制杂交液（H2），以2×SSPE缓冲液为溶剂将SDS配制为0.1wt%浓度。配制酶孵育液（H3），以2×SSPE缓冲液为溶剂将SDS配制为0.5wt%浓度。配制底物显色液（H5），含0.15mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP），0.30mg/mL氯化硝基四氮唑兰（NBT），5mmol/LMgCl2和100mmol/LTris-H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测多种动物源成分的试剂盒，包括膜芯片，所述膜芯片由支持膜和固定于支持膜上的探针组成；所述探针为检测猪、羊、牦牛、驴和鼠的特异性探针，其序列如Seq No. 1‑5所示，各探针的5’端带有氨基标记。

【技术特征摘要】
1.一种检测多种动物源成分的试剂盒，包括膜芯片，所述膜芯片由支持膜和固定于支持膜上的探针组成；所述探针为检测猪、羊、牦牛、驴和鼠的特异性探针，其序列如SeqNo.1-5所示，各探针的5’端带有氨基标记。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，支持膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚丙烯膜。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测内参基因的内参探针、阳性探针和阴性探针的膜芯片，其序列如SeqNo.6-8所示，各探针的5’端带有氨基标记。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括5’端带生物素标记的阳性寡核苷酸单链DNA，其序列如SeqNo.9所示。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括碱性磷酸酶标记链霉亲和素，底物显色液，去活化液，杂交液，酶孵育液；所述去活化液为100mmol/LNaOH。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括猪、羊、牦牛、驴和小鼠成分的扩增引物对和内...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍胜楠，任易婕，孟静，郑世超，伊廷存，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37