一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法，本发明专利技术先使用单链DNA与miRNA进行结合，再使用DSN酶对配对的单链DNA进行消化，最后通过Taqman方法对剩余的单链DNA进行定量，从而间接实现地对目标miRNA含量的检测。本发明专利技术避免了传统方法扩增时的非特异扩增问题，仍使用成熟的Taqman技术，应用极为方便、稳定。基于上述优点，本方法在肿瘤检测领域，具有广泛的应用前景。

An indirect real time fluorescent quantitative PCR detection method for miRNA

The invention discloses an indirect real-time fluorescence quantitative PCR detection method for miRNA, the first use of single stranded DNA combine with miRNA, then use DSN single stranded DNA pairs of enzyme digestion, and finally through the Taqman method of single stranded DNA remaining, and thus indirectly to achieve target miRNA content detection. The invention avoids the non-specific amplification problem when the traditional method is amplified, and still uses the mature Taqman technology, so the application is extremely convenient and stable. Based on the above advantages, this method has broad application prospects in the field of tumor detection.

【技术实现步骤摘要】
一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法
本专利技术属于分子生物
，一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
miRNA是一类内源性长约22个nt的非编码微小RNA，有如下结构特点：miRNA普遍存在于真核生物中，它不编码蛋白质，本身不具有开放阅读框；成熟的miRNA并不是简单的RNA降解片段，它的5’端和3’端分别连接了磷酸基团和羟基，且5’端的第一个碱基对尿嘧啶(U)有强烈倾向性，而对鸟嘿岭(G)有一定抗性。miRNA基因序列并不是随机排列的，一些是成簇的(cluster)，而且簇生排列的基因常常协同表达；绝大多数的miRNA是由前体miRNA(PrecursormiRNA，Pre-miRNA)的一条臂上加工而产生的，鲜有miRNA由Pre-miRNA的两条臂同时产生。miRNA的表达具有明显组织特异性和细胞特异性，还有一定的时序性，其序列还具有高度保守性的特点。研究表明，miRNA调控人类约30％以上的基因表达,从而参与到多种生命过程。现有许多证据表明，miRNA表达水平异常与人类肿瘤发生有莫大关联。目前认为，miRNA的下调或上调可能导致原癌基因的激本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)合成单链DNA，该单链DNA含有能与目标miRNA进行碱基互补的片段1，片段1的5'端和3'端分别连有碱基数不少于20bp的片段2和片段3；2)杂交消化：将上述合成的单链DNA与待测样品进行杂交，使用DSN酶对杂交体中的DNA进行消化；3)将经过杂交消化的待测样品进行实时荧光定量PCR，检测DSN酶消化后剩下的单链DNA的Ct值；根据目标miRNA的阳性质控品所建立的标准曲线，确定该Ct值所对应的目标miRNA的浓度，从而得出待测样品中目标miRNA的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)合成单链DNA，该单链DNA含有能与目标miRNA进行碱基互补的片段1，片段1的5'端和3'端分别连有碱基数不少于20bp的片段2和片段3；2)杂交消化：将上述合成的单链DNA与待测样品进行杂交，使用DSN酶对杂交体中的DNA进行消化；3)将经过杂交消化的待测样品进行实时荧光定量PCR，检测DSN酶消化后剩下的单链DNA的Ct值；根据目标miRNA的阳性质控品所建立的标准曲线，确定该Ct值所对应的目标miRNA的浓度，从而得出待测样品中目标miRNA的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述片段2和片段3的碱基序列与目标miRNA所属物种的基因组不具有同源性。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，杂交消化的反应过程为55～65℃30～60min，92～97℃10～20min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，杂交消化的反应体系中单链DNA加入的量为使其终浓度为103～108copies/mL。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，实时荧光定量PCR扩增出来的片段含有片段1，或者含有片段1的6bp以上碱基序列。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标miRNA为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓玮，张新，邓可基，彭春梅，李家导，张嘉，乐小炎，李海茵，罗园香，杨芬，
申请(专利权)人：广州海力特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44