The invention discloses a porcine reproductive and respiratory syndrome virus swine flu virus reconstruction virus vaccine and preparation method and application thereof. The vaccine contains porcine reproductive and respiratory syndrome virus swine influenza virus virus antigen and adjuvant reconstruction of stable complexes, the porcine reproductive and respiratory syndrome virus swine flu virus is reconstructed by porcine reproductive and respiratory syndrome virus through a combination of direct adsorption or covalent formation in the swine flu virus in surface reconstruction the swine flu virus, the virus is a small reconstruction capsule containing phospholipid bilayer vesicles in the bilayer surface combined with swine influenza virus hemagglutinin and neuraminidase protein. The vaccine prepared by the invention has the advantages of safety, high efficiency, convenient use, long effect period, etc.. The purpose of reducing and / or eliminating respiratory syndrome virus and / or swine influenza virus is by intranasal immunization.
【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗及其制备方法和用途。本专利技术属于生物医药或兽医生物制品
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合症(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是猪的慢性病，在全球养殖猪的国家流行，每年造成经济损失约400亿，是猪养殖和肉类产业最重要的传染病之一。自PRRSV病毒发现以来，国内外开发了灭活和减毒修饰活疫苗(Modifiedlive，PRRS-MLV)用于PRRSV控制。尽管如此，PRRS-MLV对易感猪有重组变异风险，活疫苗株也有毒力返祖的可能，对异型基因病毒攻击保护水平低，不能消除病毒感染或持续感染、排毒。灭活疫苗尽管安全性好，但免疫原性弱,免疫效果不佳。因此，急需研制出一种安全、高效、且能够实现对病毒交叉保护的非传染性PRRSV疫苗。猪流感感染引起养猪业巨大的经济损失，是公共卫生和养猪业危害最大的疾病之一。猪流感是甲型流感病毒(SwineinfluenzaAvirus，SIAV...
【技术保护点】
一种猪繁殖与呼吸综合症病毒‑猪流感病毒重构病毒体疫苗，其特征在于，含有猪繁殖与呼吸综合症病毒‑猪流感病毒重构病毒体抗原和稳定佐剂复合物，所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒‑猪流感病毒重构病毒体是由猪繁殖与呼吸综合症病毒通过直接吸附或是共价结合在猪流感病毒重构病毒体表面形成，其中，所述的猪流感病毒重构病毒体是含有磷脂双分子层的小囊泡，在磷脂双分子层的表面结合有猪流感病毒血凝素(haemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗，其特征在于，含有猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体抗原和稳定佐剂复合物，所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体是由猪繁殖与呼吸综合症病毒通过直接吸附或是共价结合在猪流感病毒重构病毒体表面形成，其中，所述的猪流感病毒重构病毒体是含有磷脂双分子层的小囊泡，在磷脂双分子层的表面结合有猪流感病毒血凝素(haemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)蛋白。2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗，其特征在于，所述的稳定佐剂复合物为含有2.0～10g/L必需和非必需氨基酸混合物、20～25g/L多聚赖氨酸羟甲基纤维素复合物(PolyICLC)、0.1-0.5mg/L卡介菌裂解物、30～100g/L双糖、30～100g/L多元醇、1.0～5.0g/L尿素或尿素衍生物、0.01～0.4g/LEDTA或EDTA盐、0.001～0.1g/L表面活性剂的10～100mM的缓冲溶液，pH值7.0～9.0，优选pH7.2-8.0。3.如权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗，其特征在于，所述的必需和非必需氨基酸混合物至少包含精氨酸或精氨酸盐以及谷氨酸或谷氨酸盐；所述的双糖为非动物源性双糖，优选麦芽糖、岩藻糖或蔗糖其中至少一种，所述的多元醇为非动物源性多元醇，优选山梨糖醇或甘露糖醇或其组合，所述的表面活性剂为非离子表面活性剂，优选吐温-20或PluronicF68；所述的缓冲溶液选自磷酸缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液的任意一种或一种以上按任意体积比例所组成的混合物。4.如权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗，其特征在于，所述的卡介菌裂解物按照以下方法制备：卡介菌用改良苏通综合培养基37℃静止培养2-3周，培养物于121℃下30分钟进行杀菌处理，用制备型低速离心机收获菌体，PBS洗涤2次，悬浮于含EDTA、蛋白酶抑制剂、DNA酶、RNA酶的PBS中，用玻璃珠破碎细菌，直到90％的菌体破碎，离心沉淀未破碎的细胞、不溶的细胞壁成分，收获裂解上清液；上清液经0.2μM、低蛋白结合的膜过滤，获得全菌体裂解物，其中内毒素水平应不高于0.002μg/mg蛋白。5.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗，其特征在于，所述的疫苗中，猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体抗原含量为4-8μg/ml。6.一种制备如权利要求1-5任一项所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)纯化灭活的PRRSV全病毒抗原的制备；(2)纯化灭活的猪流感病毒全病毒抗原的制备；(3)猪流感病毒重构病毒体的制备a磷脂分散液的制备用含有pH7.3，0.1MNaCl的0.01MTris/HCl在匀质器上制备含磷脂以及胆固醇混合物的分散液，其中所述的磷脂与胆固醇的混合物中含有按照重量百分比计的75％磷脂酰胆碱、20％的磷脂酰乙醇胺以及5％的胆固醇，其中所有磷脂占分散液的1-2％(w/v)，将胆酸钠加入分散液中，使其终浓度为1.3％(w/v)；b猪流感病毒外膜蛋白的制备向纯化的猪流感病毒病毒液中加入含0.1M八甘醇单正十二烷基醚、7.9mg/mlNaCl，4.4mg/ml柠檬酸钠、2.1mg/mlMES、1.2mg/mlN-羟乙基-哌嗪-N'-2-乙磺酸的pH7.3的水溶液，混合物在超速离心机离心，收取上清液，获得病毒外膜蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；c猪流感病毒重构病毒体的制备将步骤b获得的上清液加入步骤a获得的磷脂分散液中，在4℃搅拌，上样SephadexG-50层析柱，柱子放置在水浴中与超声仪相连，每分钟超声震荡10秒产生猪流感病毒重构病毒体，重构流感病毒体和胆固醇微囊在外水部分流出，收集外水体积部分，将含猪流感病毒重构体的外水合并，在同样条件下重新层析，获得猪流感病毒重构体；(4)猪繁殖与呼吸综合症病毒与猪流感病毒重构病毒体的偶联将步骤(1)获得的灭活纯化的PRRSV全病毒抗原和步骤(2)获得的猪流感病毒重构体混合、轻轻摇动重悬，在20℃轻轻搅拌48小时使PRRSV通过范德华力吸附于猪流感病毒重构病毒体的表面，得到猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体；或者利用PRRSV表面已经存在二硫键与猪流感病毒重构病毒体进行共价结合。7.一种制备如权利要求1-5任一项所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒-猪流感病毒重构病毒体疫苗方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)纯化灭活的PRRSV全病毒抗原的制备(2)PRRSV的硫醇化灭活纯化的PRRSV溶于0.1M磷酸缓冲液中；N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP)和乙醇混合，取...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕宏亮，董金杰，张杰，田波，邓瑞雪，王会保，刘萍，刘西兰，景志忠，高世杰，王超英，张云德，张永光，殷宏，
申请(专利权)人：中农威特生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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