一种基因重组活载体疫苗制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种基因重组活载体疫苗及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。本发明专利技术的基因重组活载体疫苗以保藏编号为CCTCC NO:V201707的H9亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒(rHVT‑H9‑HA株)为抗原制备的。基因重组活载体疫苗能有效的诱导细胞免疫和粘膜免疫应答。本发明专利技术的疫苗能持续提高SPF鸡的抗体，在H9亚型AIV攻毒之后，与对照组相比，本发明专利技术基因重组活载体疫苗免疫组试验鸡的抗体水平迅速上升，攻毒保护率为100％。

A recombinant live vector vaccine

The aim of the invention is to provide a gene recombinant live vector vaccine and its preparation method, so as to make up for the deficiency of the existing technology. The invention of the recombinant live vector vaccine with the preservation number is CCTCC NO:V201707 recombinant H9 subtype avian influenza virus HA gene of herpesvirus of Turkey (rHVT H9 HA strain) for antigen preparation. Gene recombinant live vector vaccine can effectively induce cellular immunity and mucosal immune response. The vaccine of the invention can continue to improve the antibody of SPF chicken, after H9 subtype infection of AIV, compared with the control group, the antibody level of the gene recombinant live vector vaccine immune group test chickens increased rapidly, protective rate was 100%.

【技术实现步骤摘要】
一种基因重组活载体疫苗
本专利技术属于疫苗制备
，具体涉及一种基因重组活载体疫苗。
技术介绍
Kawamura，Witter等人于20世纪60年代末期从火鸡体内分离得到一种无致病性的疱疹病毒，因此被命名为火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey,HVT)。在遗传学和血清学上，HVT与高致病性、高传染性的马立克氏氏病毒(MDV)具有抗原相关性。因此，HVT作为疫苗被广泛应用于马立克氏病的预防。马立克氏病是目前唯一一种可以通过疫苗接种进行预防的禽类肿瘤性疾病，因此，马立克氏病毒得到医学界、兽医学界的普遍关注。HVT是一种在火鸡中普遍存在的，对家禽没有致病性的病毒，根据遗传学和血清学分类：HVT被划分为MDV-3型；MDV-1型是一种引起家禽产生病理性临床症状的血清型，发病鸡表现为B细胞溶解，T细胞呈现潜伏感染并诱导T细胞淋巴瘤的形成；MDV-2型是一种不致病或产生小型蚀斑的血清型。按照最新的分类方法，国际病毒分类委员(ICTV)又将三种血清型的病毒归属于α-疱疹病毒亚科、类鸡马立克氏病毒属的成员，MDV-1型归属于禽疱疹病毒2型(Gallidherpesvirustype2,GaHV-2)，MDV-2型归属于禽疱疹病毒3型(Gallidherpesvirustype3,GaHV-3)，MDV-3型属于火鸡疱疹病毒1型(Meleagridherpesvirustype1,MeHV-1)。HVT对鸡不具有致病性，但是可以诱导病毒血症的产生，这与HVT诱导产生对MDV-1型病毒的免疫保护反应有关。鸡感染HVT后会长期带毒并且能够表现持续的免疫保护反应。HVT在皮肤细胞上的复制效率比MDV-1型致弱毒株和MDV-2型毒株明显低得多，这可能与HVT在鸡上极低的水平传播能力有关。目前用于构建重组病毒的活载体有很多，如马立克氏病毒(MDV-1)、火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、鸭瘟病毒(DEV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡痘病毒(FPV)等。与其他禽病毒载体相比，HVT具有很多独特的优势。其优势主要包括：HVT有20多个可供外源基因插入的复制非必需区，因此其复制非必需区可以插入较长外源基因，有利于构建多价重组活疫苗，其中已报道的复制非必需区有US1、US2、US3、US6、US10、US7、UL23、UL44、UL45、UL46、TK、PK等；HVT可在鸡体内持续感染，为外源基因的表达提供良好的活载体，可以刺激机体持续的产生抗体；HVT作为疫苗对鸡无致病性，不影响其生产性能，安全性好；HVT可刺激机体产生坚强的细胞免疫反应，且持续时间长，接种一次可达到终生免疫的效果；HVT具有很强的细胞结合特性，可以在细胞间传播；以HVT为载体的基因工程苗可以突破母源抗体的干扰等。因此，以HVT为载体的基因工程苗具有广阔的应用前景。就AIV而言，HA蛋白作为主要免疫保护性抗原，是体液免疫的靶抗原，主要诱导机体产生中和抗体，因此如何能够以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体进行H9亚型禽流感病的活疫苗研究成为一项亟待攻克的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因重组活载体疫苗及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的疫苗能持续提高SPF鸡的抗体，在H9亚型AIV攻毒之后，与对照组相比，本专利技术基因重组活载体疫苗免疫组试验鸡的抗体水平迅速上升，攻毒保护率为100％。本专利技术所提供的疫苗，是以表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒(rHVT-H9-HA)株作为抗原制备的；本专利技术所提供的表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒(rHVT-H9-HA)株，于2017年1月18日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201707。上述的疫苗为基因重组活载体疫苗。上述疫苗的病毒含量为每羽份5000PFU。本专利技术的疫苗保存于液氮中，保护剂为渗透性保护剂DMSO。附图说明图1：转移的构建模式图；图2：重组病毒rHVT-H9-HA的构建示意图；图3：HA基因及其表达盒PCR电泳图；图4：重组病毒rHVT-EGFP的荧光图；图5：重组病毒rHVT-H9-HA的噬斑图；图6：鉴定重组病毒rHVT-H9-HA外源基因表达的IFA试验；图7：鉴定重组病毒rHVT-H9-HA外源基因表达的Western-Blot试验图片。图8：HVT和重组病毒在CEF上的生长曲线图。具体实施情况下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例11实验材料1.1毒株、菌株和质粒HVTFC-126疫苗株由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保存。H9亚型AIVA/Chicken/YangZhou/14/0706(H9N2)株(YZ140706株)由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保藏。感受态细胞Trans-T1购自北京全式金生物技术有限公司；鸡胚成纤维细胞系(DF-1)由青岛易邦生物工程有限公司保藏。质粒：pEASY-T3，pEASY-Blunt，pEASY-M1购自北京全式金生物科技有限公司；PCR2.1、pT-EGFP由本扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保存，其中pT-EGFP包含表达绿色荧光蛋白(GFP)的表达盒，表达盒两端分别有NotⅠ和AvrⅡ酶切位点。2实验方法2.1中间转移载体pFR的构建2.1.1同源臂引物的设计选择HVT的US2区插入外源基因，参照GenBank中登录的HVTFC126株(登录号：AF291866)的全基因序列，用PrimerPremier5.0引物设计软件设计两对引物，分别PCR扩增Fwd、Rev同源臂。Fwd同源臂上游引入KpnⅠ酶切位点，下游引入SpeⅠ和AvrⅡ酶切位点。Rev同源臂上游引入NotⅠ酶切位点，下游引入ApaⅠ酶切位点。引物序列如下：Fwd-F:5'-GAAggtaccTTCTAAATGGAAAGAAAACAAGGCG-3'Fwd-R:5'-AAAactagtcctaggACGTTCCCCAGCTGCAGGGGCTT-3'Rev-F:AAAgcggccgcGAGCCGATAATTTGATATACGCRev-R:TATTgggcccGGAGCGAGAGATGAAAGAATACT引物用超纯水稀释至10μM，-20℃保存备用。2.1.2转移载体pFR的构建以HVTFC-126株感染CEF病变细胞的总DNA为模板，分别以Fwd-F/Fwd-R和Rev-F/Rev-R为引物扩增Fwd、Rev同源臂，回收目的片段。回收产物与pEASYTM-T3克隆载体进行连接转化。测序鉴定正确的克隆，分别命名为pT-Fwd和pT-Rev，提取质粒，置于-20℃冰箱保存备用。将质粒pT-Fwd和pCR2.1用KpnⅠ、SpeⅠ进行酶切，1％凝胶电泳后切胶回收pT-Fwd载体中的Fwd片段和线性化pCR2.1载体。将回收后的Fwd片段和线性化载体pCR2.1连接，构建质粒p-F。将质粒pT-Rev和p-F用NotⅠ和ApaⅠ进行酶切，1％凝胶电泳后切胶回收pT-Rev载体中的Rev片段和线性化载体p-F，将回收后的Rev片段和线性化载体p-F连接，构建质粒p-FR。2.2真核表达载体pT-cmv-HA的构建2.2.1引物设计参照GenBank中登本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗是以保藏编号为CCTCC NO:V201707的H9亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒为抗原制备的。

【技术特征摘要】
1.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗是以保藏编号为CCTCCNO:V201707的H9亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒为抗原制备的。2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗为重组活载体疫苗。3.如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述的重组活载体疫苗的病毒含量为每羽份5000PFU。4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗保存于液氮中，保护剂为渗透性保护剂DMSO。5.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：将H9亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒接种单层CEF细胞，待病变达85％以上收获病毒；收获方法如下：1)将培养液弃掉，加入适量胰...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜元钊，楚电峰，刘秋云，侯玉超，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37