本发明专利技术公开了一种调控叶黄素生物合成的转录因子基因及其应用。其中转录因子基因TePTF1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；该转录因子编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。在万寿菊成熟花组织中克隆获得了TePTF1基因。实时定量分析表明，TePTF1基因在成熟花中的表达量较未成熟花明显增加。当在烟草叶片中瞬时表达TePTF1基因时，叶黄素含量增加。所述SEQ ID NO.1基因在植物叶黄素生物合成中发挥正调控作用，本发明专利技术从色素万寿菊中所克隆转录因子TePTF1能够用于提高植物叶黄素含量。
Transcription factor gene regulating lutein synthesis and its application
The present invention discloses a transcription factor gene for regulating lutein biosynthesis and its application. The transcription factor TePTF1 gene nucleotide sequence in the sequence table SEQ ID NO.1 shown; the amino acid sequence of the transcription factor encoding protein as shown in the sequence list SEQ ID NO.2. TePTF1 gene was cloned from mature flower tissue of marigold. Real time quantitative analysis showed that the expression of TePTF1 gene in mature flowers was significantly higher than that in immature flowers. When the TePTF1 gene was transiently expressed in tobacco leaves, the content of lutein increased. The SEQ ID NO.1 gene play a positive regulatory role in the biosynthesis of lutein in plants, the invention from Marigold by cloning of transcription factor TePTF1 can be used to improve the lutein content in plants.
【技术实现步骤摘要】
调控叶黄素合成的转录因子基因及其应用
本专利技术涉及植物遗传工程
，具体涉及从色素万寿菊中克隆叶黄素生物合成转录因子TePTF1，该基因的核苷酸序列、蛋白质序列，及利用TePTF1基因在调节植物叶黄素合成中的应用。
技术介绍
万寿菊(TageteserectaL.)是一种在世界各地广泛种植的菊科万寿菊属植物。它原产美洲墨西哥等地，其花花形大、花色多样、花期长、植株适应能力强、生产周期短(汪殿蓓等，《北方园艺》，2007，1：44-46)。万寿菊花可提取多种次生代谢产物。据《食品科学》(李大婧等，2005，9：582-586)介绍，万寿菊花萃取物有93％可利用的色素，其中全反式和顺式叶黄素、叶黄素酯占88％，全反式和顺式玉米黄质占5％。Antony等报道(TheworldofFoodingredients，2001，4-5：65-67)万寿菊花提取物主要成分为叶黄素酯，占花瓣色素含量的90％。Philip和Berry的研究(JournalofAgriculturalandFoodChemistry，1999，47(10)：4189-4194.)也认为，万寿菊花中叶黄素含量在常见类胡萝卜素来源植物中最高。叶黄素属于类胡萝卜素类色素，分子式为C4OH56O2，相对分子量为568.85。橙黄色粉末，浆状或液体，不溶于水，溶于己烷等有机溶剂。多数叶黄素在植物体内均以酯形式存在，而非游离态。在人体内不能合成叶黄素，但是可以利用叶黄素酯，使其在体内转化成为游离叶黄素(许秀兰等，《粮食与油脂》，2004，10：3-7)。由于叶黄素在人体不能合成，又因其有多种异构体，也难采用化学方法合成，需要从天然植物中提取。虽然在叶黄素广泛存在于水果蔬菜中，但其含量及其微少，日常饮食摄入不足。叶黄素能防止人体机体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤病等。叶黄素在预防老年性眼球视网膜黄斑区病变引起的视力下降与失明也具有独特功能。因此，1995年美国食品药品管理局(FoodandDrugAdministration)批准将叶黄素作为食品补充剂。虽然叶黄素价格昂贵，有“软黄金”之称，但由于叶黄素在禽类养殖、医药、食品、化妆品中的广泛应用，国内外对其需求量逐年增加，富含这一成分又能大面积推广种植的色素万寿菊因而成为提取天然叶黄素的重要植物资源(《新疆农垦经济》，2012，6：52-55)。我国万寿菊育种基础研究方面进展缓慢，至今没有培育出能够真正替代欧美品种的新品种，主要原因是对其遗传研究的缺乏。据《西北农业学报》(李浦等，2012，5；174-178)介绍，对万寿菊的遗传分析表明叶黄素含量性状以主基因遗传效应为主，多基因效应为辅。叶黄素是类胡萝卜素中的含氧多萜类物质。在植物体内，合成前体异戊烯基焦磷酸通过多次缩合、脱氢、环化、羟基化、环氧化等过程转化为类胡萝卜素。通过拟南芥、玉米、番茄、矮牵牛花等模式植物的研究，发现类胡萝卜素合成主要受两类基因影响：一类是结构基因，直接编码与类胡萝卜素生物合成有关的各种酶类；另一类是调控基因，其编码的转录因子参与调节结构基因的表达。其中Myb、Myc类转录因子在植物花色物质合成中发挥重要作用。目前，在万寿菊花发育过程中特异上调或下调，从而控制花色素成分合成的转录因子基因尚未克隆分离。对这些色素调控基因的利用将可用于培育高叶黄素含量的植物资源，满足食品、医药、化妆品等领域对天然色素的需求。
技术实现思路
本专利技术属于植物遗传工程
，具体涉及从色素万寿菊中克隆叶黄素生物合成转录因子TePTF1，该基因的核苷酸序列、蛋白质序列，及利用该基因在调节植物叶黄素合成中的应用。本专利技术从色素万寿菊中克隆叶黄素合成转录因子，命名为TageteserectaPositiveTranscriptionFactor1(简称TePTF1)；其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。本专利技术从色素万寿菊成熟花中进行TePTF1基因的克隆：根据对色素万寿菊的高通量转录组深度测序对TePTF1基因进行数据组装；然后利用引物设计软件PrimerPremier5.0设计2对巢式PCR特异引物，从万寿菊花瓣中提取总RNA，反转录PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)克隆获得TePTF1基因。本专利技术通过万寿菊未成熟、成熟花组织的实时定量分析和烟草瞬时表达样品中叶黄素含量测量，表明本专利技术所述SEQIDNO.1基因在叶黄素合成调控方面具有作用，能够用于提高植物中叶黄素等类胡萝卜素色素的含量。本专利技术所述叶黄素合成转录因子TePTF1的有益效果是：为在植物中提高叶黄素等类胡萝卜素色素含量提供了一种新的调控基因资源，可用于高色素营养品质植物材料的筛选、培育和改良。具体实施方式下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如SambrookJ.和Russell，D.W.的分子克隆实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：万寿菊高通量转录组测序由于万寿菊基因组尚未测定，为获得万寿菊功能基因转录本序列，利用色素万寿菊栽培品种菊王组织样品，通过分别提取三个单株的叶、未成熟花、成熟花RNA各1份，进行高通量转录组序列测定与组装注释。1、试剂植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(DnaseI)购于Takara公司，RNA文库制备试剂盒(RNALibraryPrepKit)购于北京百迈客生物科技有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。2、植物材料色素万寿菊(TageteserectaL.)栽培品种菊王由赤峰鑫卉园艺公司繁育提供。3、方法3.1RNA提取1)使用液氮研磨法破碎100mg植物组织，移至1.5mL离心管中，加入1mlTrizol，剧烈震荡，室温放置5min；2)离心管中加入200μL氯仿，振荡30s混匀，室温放置5min；3)4℃，12000rpm离心15min，RNA位于上清液，下侧有机相含有叶绿素等杂质；4)将上清液700μL移至1.5mL离心管中，下层有机相和中间层有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；5)在上清液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min；6)4℃，12000rpm离心15min，弃上清，RNA沉于管底；7)加入1mL70％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；9)室温干燥5-10min；10)加入50μL无RNA酶水(RNase-freeH2O)，溶解RNA；11)根据RNA溶液浓度取RNA50μg，加入5μL10X缓冲液(400mMTris-HCL，pH7.5，80mMMgCl2，50mM)、5μLDnaseI、2μLRNA酶抑制剂，37℃反应30min；12)加入2.5μL0.5MEDTA，80℃，2min失活Dnase；13)加入10μL3M醋酸钠和250μL预冷的乙醇，-80℃放置20min；14)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；15)加入1mL70％乙醇清洗RNA；16)4℃，120本文档来自技高网...
【技术保护点】
调控万寿菊叶黄素合成的转录因子基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.调控万寿菊叶黄素合成的转录因子基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述转录...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛向丽，冯国栋，黄胜雄，马飞，毛云，张政，刘永胜，王洋，王莹莹，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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