一种烟草尼古丁含量调控基因NtCLC‑b及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草尼古丁含量调控基因

With the application of a regulation of nicotine content in tobacco NtCLC gene B and cloning method

The present invention discloses a nicotine content regulation gene in tobacco

【技术实现步骤摘要】
一种烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，进一步属于涉及烟草尼古丁的合成及调控相关基因，具体涉及一种烟草尼古丁含量的调控基因NtCLC-b及其克隆方法与应用。
技术介绍
研究烟草尼古丁的代谢调控是非常有意义的一项工作，通过基因调控可以提供不同尼古丁含量的烟草品种，为烟草商业生产个性化尼古丁烟草产品提供原材料。尼古丁对人体有很强的生理刺激作用，是烟草商业性使用的物质基础。许多世界顶级烟草公司如菲利普莫里斯，帝国烟草、日本烟草、英美烟草等公司都投入巨资对烟草尼古丁的代谢途径、调控机制进行研究。尼古丁是一种吡啶类生物碱，主要存在于茄科烟草属(Nicotiana)植物中，是烟草体内的一种重要的次生代谢产物。烟草尼古丁的合成和转运受到多个因素的调控，目前已经鉴别和克隆出来了一些尼古丁合成途径中的关键基因，如QPT、PMT、MPO、JAZ、MYC2a等。从分子生物学角度对尼古丁的合成代谢途径研究尚未完全透彻。通过氯离子通道调控尼古丁合成基因，从而影响尼古丁含量的研究未见报道。尼古丁调控基因对于烟草商业生产至关重要，目前大多数的尼古丁合成基因相关专利都掌握在国外烟草公司手中。因此，研究尼古丁合成途径相关调控基因对中国烟草企业改良烟草产品中尼古丁含量具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b，所述基因编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。本专利技术的第二目的在于提供所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b包含的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQID：No.1所示。本专利技术的第三目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的克隆方法，包括以下步骤：（1）烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；（2）NtCLC-b基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtCLC-b基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。本专利技术的第四目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的应用，即在烟草植株体内过量表达所述NtCLC-b基因，可降低烟草中尼古丁的含量。本专利技术的第五目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的重组载体。本专利技术的第六目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的表达盒。本专利技术的第七目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的转基因细胞系。本专利技术的第八目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的重组菌。附图说明图1NtCLC-b的PCR产物电泳图；图中，M-分子量标记；1-PCR产物；图2中间载体Pdonr-zeo图；图3NtCLC-b基因植物表达载体PB2GW7图；图4转NtCLC-b基因过表达载体的烟草株系基因表达水平柱状图；图中，OE-1为过表达1株系，OE-2为过表达2株系，K326为野生型烟株对照；图5NtCLC-b基因过表达烟草植株的尼古丁含量。图中，OE-1为过表达1株系，OE-2为过表达2株系，K326为野生型烟株对照。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所做的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。所述多肽还可能为由SEQIDNo：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有调控烟草尼古丁含量的衍生多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。本专利技术所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b包含的核苷酸序列如SEQID：No.1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本专利技术所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的克隆方法包括以下步骤：（1）烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；（2）NtCLC-b基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtCLC-b基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物并测序。作为本专利技术的一种优选，所述引物为：正向引物：5’-ATGGAGGAGCCAACTCGATTAGTAG-3’；反向引物：5’-TCAGTTCCCCTTTTTACCGCTTTTTG-3’。本专利技术所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的应用为在烟草植株体内过量表达所述NtCLC-b基因，可降低烟草中尼古丁的含量。可通过多种方法实现过量表达NtCLC-b基因，如：植物病毒载体介导基因过表达的方法、农杆菌介导转化过表达载体、优化修改基因编码匡、优化基因启动子等方法。本专利技术所述的过量表达基因的方法并不限于上述几种方法，只要能过量表达NtCLC-b即可。本专利技术的NtCLC-b基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿等。携带有本专利技术NtCLC-b基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。含有本专利技术所述NtCLC-b基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、和重组菌等基因工程产品均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的烟草尼古丁调控相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草尼古丁含量育种提供基因与技术的支持。本专利技术中，在烟草植株内过表达烟草内源NtCLC-b，会使烟草烟叶的尼古丁含量明显降低，在植物尼古丁育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。下面将结合具体实施例，对本专利技术进行进一步的说明。实施例中所有的植物组织材料取自烤烟（Nicotianiatabacum)品种‘K326’及过表达NtCLC-b基因‘K326’植株。烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中，并保持生长温度在22-25℃之间，以尽量减少外界环境因素对烟草尼古丁合成过程中的影响。实验选取的烟草材料为旺长期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株。采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。对于另一组，对非转基因烟株及转基因烟株进行打顶处理，然后采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。将这些烟草材料杀青以进行尼古丁含量检验。实施例1：克隆NtCLC-b基因以烟草叶片cDNA为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行NtCLC-b基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。设计引物如下所示：正向引物：5’-ATGGAGGAGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草尼古丁含量调控基因

【技术特征摘要】
1.一种烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b，其特征在于，所述基因编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包括的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。2.根据权利要求1所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b，其特征在于，所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b包含的核苷酸序列如SEQID：No.1所示。3.一种权利要求1或2任一所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；（2）NtCLC-b基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtCLC-b基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。4.根据权利要求3所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的克隆方法，其特征在于，所述引物为正向引物：5’-ATGGAGGAGCCAACTCGATTAGTAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：逄涛，白戈，杨大海，谢贺，李勇，姚恒，李永平，肖炳光，张谊寒，陈学军，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53