732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ‑氨基丁酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ‑氨基丁酸的方法，属于绿色生物制造技术领域；本发明专利技术分别以并联排列的732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ通过阀门控制交替作为辅助反应柱与固定化屎肠球菌细胞柱相偶联，并与其他辅助设施或设备连接形成循环反应系统，通过底物在732树脂辅助反应柱和固定化屎肠球菌细胞反应柱之间循环而进行高效催化反应，提高γ‑氨基丁酸产率；在一根732树脂柱辅助转化反应的同时，对另一根732树脂柱进行洗脱、再生和平衡，从而实现固定化屎肠球菌细胞柱在732树脂柱辅助下进行连续生产。与仅采用固定化细胞的单柱反应法相比，本发明专利技术提供的方法在相同反应时间和同等固定化屎肠球菌的条件下，单批循环的GABA产量提高178.83%。

732 resin continuous circulation method in preparation of gamma aminobutyric acid assisted immobilized cell system

The invention relates to a method for preparing a continuous cycle of 732 resin gamma aminobutyric acid assisted immobilized cell system, which belongs to the technical field of green biological manufacturing; resin column I and II control alternately as auxiliary reaction column with immobilized cell column coupled enterococcusfaecium through the valve is prepared with parallel 732 cation exchange, and the connection form circulating reaction system and other auxiliary facilities or equipment, and efficient catalytic reaction by substrate cycle between 732 resin auxiliary reaction column and immobilized cells of Enterococcus faecium reaction column, gamma aminobutyric acid increased yield; in a 732 resin column assisted conversion reaction at the same time, elution and regeneration and balance on the other according to the 732 resin column, so as to realize the immobilized cell column in 732 e.faecium resin column assisted continuous production. Compared with the single column reaction method only using immobilized cells, the method provided by the invention at the same time and the same reaction immobilized Enterococcus faecium under the condition of single batch cycle GABA production increased 178.83%.

【技术实现步骤摘要】
732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法
本专利技术涉及一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法，属于绿色生物制造领域。
技术介绍
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyricacid,GABA)是一种具有4个碳原子的非蛋白质组成氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血压、镇静和改善睡眠等作用，已成为备受关注的药品和保健品成分。由于可以通过内酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，因此GABA还是生产生物塑料聚酰胺4的重要原料。微生物生长繁殖快，以其生产GABA不受时间和空间限制，因此通过微生物GAD(Glutamatedecarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)生产GABA备受关注。GAD是一种依赖于磷酸吡哆醛(pyridoxal5′-phosphate，PLP)的裂解酶，存在于细胞质中，是生物体催化L-谷氨酸(L-Glutamicacid,L-Glu)发生α-羧基脱羧作用生成GABA的唯一酶。由于GAD作用的底物(L-Glu)和产物(GABA)均为小分子，可以透过细胞膜，因此可以直接采用细胞转化法生产GABA，减少胞内酶的提取成本，简化生产工艺。已有文献通过唾液链球菌嗜热亚种、戊糖片球菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、大肠杆菌细胞转化法制备GABA的报道。但是由于游离细胞不易回收重复使用，因此仍需要不断重复培养高GAD活力的细胞用于生产，而通过固定化技术将细胞固定或包埋于固态载体上，即制备成固定化细胞，则可克服游离细胞的缺点，并可实现连续化生产。赵景联等在文摘(生物工程学报，1989,5(2)：124-128)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1％谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA。间歇反应5h转化率达到了100％；连续搅拌式反应在三角瓶反应器中进行，以6mL/h的流速输入底物溶液和输出反应液，转化率达85％；连续柱式反应器中进行，控制流速12mL/h，转化率达95％。章汝平等在文摘(长沙电力学院学报(自然科学版)，1998,13(4)：433-435)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA，获得了GABA含量达到了98.94％，收率为49.65％。杨胜远等在中国专利(专利号200910114016.4)中公开了一种细胞转化法生产GABA的方法，它是以乳酸乳球菌的细胞作用于外源添加的谷氨酸或谷氨酸钠，生产高含量的GABA，或将乳酸乳球菌细胞采用海藻酸钠进行固定化，通过固定化细胞技术转化谷氨酸或谷氨酸钠生产GABA。焦阳、汪建敏和杨胜远等在文摘(核农学报，2009，23(6):1026-1031)中以唾液链球菌嗜热亚种Y-2为供试菌，考察了卡拉胶、明胶和海藻酸钙等材料将此菌株固定化的效果，并通过比较固定化细胞的GAD活性及γ-氨基丁酸的产量和载体机械强度，确定了海藻酸钙作为固定化细胞的适宜载体。优化后得到的最适固定化条件(w/v)为：海藻酸钠2％，CaCl214％,菌体25％，凝胶平均颗粒直径1.64mm，在此条件下测得固定化细胞的GAD活性为游离细胞的1.2倍。细胞多批次应用稳定性试验证明：固定化细胞较游离细胞有着更稳定的GAD活性，反复使用60h后，固定化细胞GAD活性仍能保持其初始活性的90％以上，γ-氨基丁酸的积累量达到7.97g/L。虽然以微生物合成GABA的公开技术较多，但是由于微生物GAD的活性普遍不高，GABA产量偏低，成本高，难以满足工业化生产需求。不管是游离酶、游离细胞或固定化细胞转化法，还是发酵法，GAD都是生物合成GABA的关键酶，其活性高低与GABA的产量直接相关。除了GAD的结构和微生物代谢产酶量外，催化反应的外部反应条件也是影响GAD活性的重要因素。因此，如何提高微生物GAD活力、提高高活力GAD细胞的产量以及通过改善细胞转化反应体系或工艺条件，提高GABA的产量，降低生产成本，将是今后亟需解决的关键问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过将732阳离子交换树脂柱与固定化屎肠球菌细胞柱偶联形成循环复合转化反应系统，通过732阳离子交换树脂对屎肠球菌GAD活性的促进作用，最终实现提高GABA产量的目的，解决生物合成GABA成本高居不下的问题，并通过采用2根732阳离子交换树脂柱交替使用，解决固定化屎肠球菌细胞柱连续生产的问题。732树脂为强酸型阳离子交换树脂，对物质具有选择吸附特性，后处理简便，价廉易得、不污染环境、不腐蚀设备，容易分离及回收，可重复使用，已广泛用于物质的分离纯化。但是，作为辅助催化剂在生物酶催化反应体系中应用尚未报道。本专利技术研究表明732阳离子交换树脂作为辅助催化剂，在与屎肠球菌游离细胞或游离GAD混合进行共催化时，屎肠球菌GAD的催化活性大幅提高，说明732阳离子交换树脂对屎肠球菌游离细胞或游离GAD活性具有显著的促进作用。本专利技术进而对732阳离子交换树脂促进屎肠球菌游离细胞转化活性的作用机制进行了深入探讨，并在此基础上将固定化屎肠球菌细胞的反应柱与732阳离子交换树脂柱偶联，专利技术了可循环的双柱式反应方法。本专利技术的方法在GABA产量上较单一固定化屎肠球菌细胞反应柱可提高1.5～2倍，并且呈现固定化屎肠球菌细胞的GAD活性越强，732阳离子交换树脂提高GABA产量的幅度越大的趋势。本专利技术的所使用的具有GAD活性的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)菌株分离自泡菜，已于2017年6月19日进行专利菌种保藏，其保藏编号为：GDMCCNO.60203，保藏名称为：EnterococcusfaeciumLNSF2，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心。保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。为了实现本专利技术的目的，专利技术人首先从反应体系pH值对屎肠球菌GDMCC60203细胞GAD转化活性的影响进行了研究。结果表明细胞GAD的最适反应pH值为4.4，当反应体系的pH值大于4.4时，细胞GAD活性迅速下降；在pH4.2～4.6范围内，屎肠球菌GDMCC60203细胞GAD的转化活性相对较强。L-Glu是GAD作用的底物，只有游离状态的L-Glu才能被GAD所催化，为此本专利技术对L-Glu和谷氨酸一钠(味精，Monosodiumglutamate，MSG)在pH4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液中的溶解度进行了测定，结果40℃时，0.3mol/LMSG已经基本接近饱和溶液，为了防止MSG结晶析出影响，本专利技术选择GAD底物MSG或L-Glu的浓度为0.2mol/L。经对比试验表明，MSG较L-Glu更易溶解，配制更方便。一些酶常具有底物抑制作用，为了考察底物L-Glu对屎肠球菌GDMCC60203细胞GAD转化活性的影响，本专利技术对不同浓度的MSG溶液(溶于pH4.2的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液)对细胞转化活性的影响进行了测定。结果表明，在0.025～0.25mol/L范围内，随着MSG溶液浓度增加，GAD转化活性增强，说明屎肠球菌GDMCC60203细胞GAD不存在底物抑制作用，而且MSG溶液浓度增加有助于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ‑氨基丁酸的方法，其特征在于，分别以并联排列的732阳离子交换树脂柱Ⅰ和732阳离子交换树脂柱Ⅱ通过阀门控制交替作为辅助反应柱与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱相偶联，并与其他辅助设施或设备连接形成循环反应系统，通过反应底物在732阳离子交换树脂柱和固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱之间循环而进行高效催化反应，提高γ‑氨基丁酸产率；在一根732阳离子交换树脂柱辅助转化反应的同时，对另一根732阳离子交换树脂柱进行洗脱、再生和平衡，从而实现固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱在732阳离子交换树脂柱辅助下进行连续生产，所述方法包括以下步骤：① 将固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞以pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸‑乙酸钠缓冲液进行装柱制备成固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱；② 将已再生或预处理的732阳离子交换树脂以pH 4.2、0.2 mol/L 乙酸‑乙酸钠缓冲液进行装柱制备成732阳离子交换树脂柱，732阳离子交换树脂柱设置2根，即732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ；③ 将固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ与调配罐、转化液贮罐、泵、循环贮罐、泵、高位罐、平衡贮罐、洗脱液贮罐、管路及阀门等连接成循环双柱反应体系，732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ采用并联安装，分别通过阀门控制，交替与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱形成循环双柱反应系统；④ 在平衡贮罐中加入3倍732阳离子交换树脂柱柱床体积的0.2 mol/L底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行平衡，备用；采用同样方法对辅助反应柱Ⅱ的732阳离子交换树脂进行平衡；⑤ 将5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的0.2 mol/L 的底物溶液用泵输送到高位罐，经高位罐流入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱，于40℃柱温下转化反应，通过监测转化液流出液的pH控制流速，使流出液pH值不大于4.6，流出的转化液贮存于转化液贮罐；⑥ 将转化液贮罐内的转化液用泵输送至732阳离子交换树脂柱Ⅰ，对产物GABA进行离子交换，减少转化液中的游离GABA浓度，732阳离子交换树脂柱Ⅰ流出液通入循环贮罐，采用3 mol/L HCl调节pH为4.2；⑦ 将循环贮罐的溶液再用泵输入固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱于40℃柱温进行反应；⑧ 按⑥和⑦进行循环反应，通过检测转化液流出液的底物浓度，以底物的摩尔转化率大于85%作为循环转化反应的终点；⑨ 第一次循环反应结束后，将732阳离子交换树脂柱Ⅰ与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱管路连通的阀门关闭，而将732阳离子交换树脂柱Ⅱ与固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱管路连通的阀门打开形成新的双柱循环系统；参照第一次循环反应的操作，采用5倍固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱柱床体积的0.2 mol/L 底物溶液在屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂柱Ⅱ之间进行新的循环反应；⑩ 在第二次循环反应生产期间，开通洗脱系统，将0.15 mol/L Na2CO3溶液通过泵输送到732阳离子交换树脂柱Ⅰ，对辅助反应柱Ⅰ732阳离子交换树脂交换的GABA进行洗脱，合并或分别收集洗脱液和转化反应液经732阳离子交换树脂柱的流出液，即可获得纯度不同的GABA母液；接着通过洗脱系统，按照732阳离子交换树脂说明书的再生方法和步骤④所述的平衡方法，先后更换为NaOH、HCl、软水和0.2 mol/L 底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行再生和平衡，备用；按照④～⑩所述的方法，交替使用732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ即可实现固定化屎肠球菌GDMCC 60203细胞反应柱的连续生产；所述底物为...

【技术特征摘要】
1.一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，分别以并联排列的732阳离子交换树脂柱Ⅰ和732阳离子交换树脂柱Ⅱ通过阀门控制交替作为辅助反应柱与固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱相偶联，并与其他辅助设施或设备连接形成循环反应系统，通过反应底物在732阳离子交换树脂柱和固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱之间循环而进行高效催化反应，提高γ-氨基丁酸产率；在一根732阳离子交换树脂柱辅助转化反应的同时，对另一根732阳离子交换树脂柱进行洗脱、再生和平衡，从而实现固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱在732阳离子交换树脂柱辅助下进行连续生产，所述方法包括以下步骤：①将固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞以pH4.2、0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱；②将已再生或预处理的732阳离子交换树脂以pH4.2、0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液进行装柱制备成732阳离子交换树脂柱，732阳离子交换树脂柱设置2根，即732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ；③将固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱和732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ与调配罐、转化液贮罐、泵、循环贮罐、泵、高位罐、平衡贮罐、洗脱液贮罐、管路及阀门等连接成循环双柱反应体系，732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ采用并联安装，分别通过阀门控制，交替与固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱形成循环双柱反应系统；④在平衡贮罐中加入3倍732阳离子交换树脂柱柱床体积的0.2mol/L底物溶液，对辅助反应柱Ⅰ的732阳离子交换树脂进行平衡，备用；采用同样方法对辅助反应柱Ⅱ的732阳离子交换树脂进行平衡；⑤将5倍固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱柱床体积的0.2mol/L的底物溶液用泵输送到高位罐，经高位罐流入固定化屎肠球菌GDMCC60203细胞反应柱，于40℃柱温下转化反应，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨胜远，韦锦，
申请(专利权)人：岭南师范学院，
类型：发明
国别省市：广东,44