一种检测4种致病菌的四重实时荧光PCR方法技术

一种检测4种致病菌的四重荧光PCR方法，4种致病菌是金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌；该方法具有样品DNA、一对通用引物和四条探针、荧光PCR预混液、阳性对照4要素；根据4种菌的16S rRNA基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发相应的荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；具体做法包括：建立检测4种菌的四重荧光PCR引物体系；建立检测4种菌的四重荧光PCR试剂盒；确定检测4种菌的四重荧光PCR鉴定方法。本发明专利技术具有标准误差小、检测时间短、可同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点，适用于食品和化妆品的致病菌检测。

A four real time fluorescent PCR method for detection of 4 pathogenic bacteria

A detection of 4 pathogenic bacteria four fluorescent PCR method, 4 kinds of pathogenic bacteria were Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes Lester bacteria, Vibrio parahaemolyticus; this method is sample DNA, a pair of universal primers and four probes and fluorescent PCR premixed liquid, positive control according to the 4 elements; 4 kinds of bacteria 16S rRNA gene primers and probes, the target sequence was amplified and fluorescence signal corresponding to the sample to be tested; DNA reagent formula of fluorescent PCR amplification and amplification condition kit; specific practices include: four fluorescence PCR primer system was established to detect 4 kinds of bacteria four; fluorescent PCR kit was established to detect 4 kinds of bacteria; Determination of 4 kinds of bacteria of four PCR fluorescence identification method. The invention has the standard error is small, short detection time, can detect multiple target genes, saving the cost of reagents, detection of pathogenic bacteria for food and cosmetics.

【技术实现步骤摘要】
一种检测4种致病菌的四重实时荧光PCR方法
本专利技术涉及包括基因的鉴定方法、食品和化妆品中致病菌的检测方法，特别涉及即食性食品中致病菌的检测方法。
技术介绍
民以食为天，食品安全是社会和谐的基础支柱之一。在食品和化妆品方面，尤其在即食性食品领域，致病菌检测是食品安全重要指标之一。参考疾控防治数十年来的经验积累，当前在各种产品执行标准和各级食药监监抽细则中，即食性食品的致病菌检测项目，大多为金黄色葡萄球菌和沙门氏菌两种；主要成分为畜禽产品的增加单核细胞增生李斯特菌检测；主要成分为水产品的增加副溶血性弧菌检测。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)在环境中普遍存在，对食品的污染几率较大，人感染后表现为局部化脓感染，也可引起肠炎、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。在我国引发的食物中毒事件有2001年4月12日无锡市锡山区所辖小学和幼儿园因课间加餐饮用了被St.aureus污染的袋装牛奶饮料导致食物中毒事件等。肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)为沙门氏菌属主要种，包括多种常见的致病血清型(Sa.entericaserovarCh本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测4种致病菌的四重荧光PCR方法，具有四重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、一对通用引物和四条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；其特征在于：根据4种致病菌的16S rRNA基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发相应的荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；所述4种致病菌是：金黄色葡萄球菌，学名Staphylococcus aureus，简称St.aureus；肠道沙门氏菌，学名Salmonella enterica，简称Sa.enterica；单核细胞增生李斯特菌，学名Listeria monocytogen...

【技术特征摘要】
1.一种检测4种致病菌的四重荧光PCR方法，具有四重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、一对通用引物和四条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；其特征在于：根据4种致病菌的16SrRNA基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发相应的荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；所述4种致病菌是：金黄色葡萄球菌，学名Staphylococcusaureus，简称St.aureus；肠道沙门氏菌，学名Salmonellaenterica，简称Sa.enterica；单核细胞增生李斯特菌，学名Listeriamonocytogenes，简称L.monocytogenes；副溶血性弧菌，学名Vibrioparahemolyticus，简称V.parahemolyticus。具体的做法包括：第一步，建立检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR引物体系；第二步，建立检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR试剂盒；第三步，确定检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR鉴定方法，即以待测样品总DNA为模板，利用所述的四重荧光PCR引物体系，在可同时检测FAM、VIC、TARMA、Cy5等激发荧光基团和MGB淬灭荧光基团的四通道及以上的荧光PCR仪上进行扩增和检测。2.按照权利要求1所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR引物体系：序列1为St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的通用上游引物，序列2为St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的通用下游引物，序列3为St.aureus特异性探针，序列4为Sa.enterica特异性探针，序列5为L.monocytogenes特异性探针，序列6为V.parahemolyticus特异性探针。序列3、4、5、6在5’端分别用FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光激发基团修饰，3’端均为MGB荧光淬灭基团修饰。3.按照权利要求1所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR试剂盒成分如下所示：①引物：包括序列1、2所示引物，浓度均为20μmol/L，使用1.5mL无色透明离心管封装；②探针：包括序列3、4、5、6所示探针，浓度均为10μmol/L，使用1.5mL棕色不透明离心管封装；③荧光PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙端方，李春宇，田志强，董睿，寻思颖，肖莉，陈梅，
申请(专利权)人：贵州省产品质量监督检验院，
类型：发明
国别省市：贵州,52