一种植物乳杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种植物乳杆菌及其应用，命名为植物乳杆菌GRLP‑25，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学，保藏日期为2016年4月18日，保藏编号为CCTCC M NO：2016197，植物乳杆菌GRLP‑25可以对水产动物养殖中出现的病原菌具有敏感的抑菌活性，并且能提高水产动物免疫功能，提高动物健康水平，还可以降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的含量，改善养殖生态环境，使养殖生产良性发展，提高水产养殖的产率，取得更好的经济效益和生态效益。

Lactobacillus plantarum and its application

The present invention provides a kind of Lactobacillus plantarum and its application, named as Lactobacillus plantarum GRLP 25, preserved in China type culture collection center, Wuhan University., the collection date is 2016 years 4 months 18 days, the preservation number is CCTCC M NO:2016197, Lactobacillus plantarum GRLP 25 can have antibacterial activity of sensitive the pathogen appears in aquatic animal breeding, aquatic animal and can improve immune function, improve animal health, but also can reduce the content of ammonia and nitrite in aquaculture water, improve the ecological environment of aquaculture, aquaculture production to the healthy development of aquaculture, improve the yield, achieve better economic and ecological benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种植物乳杆菌及其应用
本专利技术提供一种植物乳杆菌及其在水产养殖中的应用，获得一种降氨氮亚硝酸盐及抗菌的功能菌，属于水产养殖技术及生态环境保护

技术介绍
罗氏沼虾养殖业是我国长三角地区村镇经济的重要产业。但目前其饲料蛋白质含量高，养殖模式粗犷，饲料蛋白利用率低，养殖废水具有氮磷含量高的特点。高密度养殖环境下，其养殖废水的污染物包括残饵、粪便和排泄物中所含的营养物质即N、P等。据报道，在喂食过程中10-20%的高蛋白饲料未被鱼虾吸收利用，直接进入养殖水体，同时被摄入体内的80-90%的利用，只有20-25%的营养物用作合成整体自身蛋白质，有60-65%营养物随粪便排出，进入水体。在养殖过程中，有约70-85%的营养物通过直接和间接方式排入水体，排泄物和残饵沉积于水中，在适宜的温度下被迅速分解，使水体中氨氮和亚硝酸盐等含量升高，进而使养殖池水生态环境恶化，容易导致其病害发生的加重，这样也就容易造成水产动物药物使用量的增加，药物残留，食品安全等一系列的问题。同时，养殖废水的无序排放已经成为周边水体富营养化的重要成因，严重影响了村镇居民生活和生产用水质量与安全，并成为制约养殖业健康可持续发展的限制性因素。因此，研制开发提高饲料利用率，降低水体氨氮以及亚硝酸盐的产品是一项迫在眉睫的任务。要解决集约化养殖中最常见的病害和水质问题，常用的解决方法有注射免疫疫苗、在饲料中添加免疫促进剂和微生态制剂。但是，疫苗因其操作繁琐，发展受到一定的阻碍，免疫促进剂也仅仅局限于动物机体免疫增强，对水体改变的作用很少。
技术实现思路
本专利技术提供一种从罗氏沼虾肠道中分离得到的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌GRLP-25，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学，保藏日期为2016年4月18日，保藏编号为CCTCCNO：M2016197。植物乳杆菌GRLP-25可净化养殖水质，改善和恢复养殖水体的生态环境；能够有效抑制肠道病菌和提高水产动物免疫机能，提高动物的抗病能力，并且能提高水产动物对饲料的消化吸收和促进生长。获得植物乳杆菌GRLP-25的具体步骤如下：一、植物乳杆菌的分离及鉴定1.1菌株的分离纯化将罗氏沼虾肠道组织匀浆用无菌生理盐水采用10倍稀释法进行稀释后，取10-5～10-8稀释范围的稀释液涂布于MRS固体培养基平板上。30℃恒温培养48h，挑取典型单菌落，反复划线分离至获得纯菌株。1.2生理生化鉴定对菌株菌落形态进行观察，革兰氏染色，显微镜观察。并参照文献提供的方法对菌株进行过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、甲基红试验（MR试验）、吲哚试验、硫化氢试验、糖发酵试验（微量发酵管法）。1.316SrRNA序列分析应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，按说明书操作。应用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R（TACCTTGTTACTT)扩增细菌的16SrDNA基因，扩增体系参照文献进行。扩增程序：95℃预变性5min后进入PCR循环，95℃变性30s，50℃退火60s，72℃延伸30s，40个循环，72℃延伸5min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳并进行回收纯化，引物合成和序列测定委托上海英骏生物工程技术有限公司完成。将序列提交GenBank数据库，利用BLASTN搜索同源序列，下载同源序列，应用软件Meg4．0进行系统发育分析，BioEdit软件分析同一性，鉴定菌株。2结果与分析2.1菌株分离应用MRS培养基从罗氏沼虾肠道中分离到一株乳酸菌，菌落成乳白色半透明凸起，边缘整齐光滑；革兰氏染色镜检呈革兰氏阳性，杆状，有酸味，将其编号为GRLP-25。2.2生理生化特征菌株GRLP-25的生理生化鉴定结果见表1，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版），初步鉴定其为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）。表1菌株GRLP-25和标准菌株的生理生化特性注：+表示阳性反应，-表示阴性反应，（+）表示迟钝反应。2.316SrRNA基因的PCR扩增结果与系统发育分析经PCR扩增得到16SrRNA片段，经测序为1448bp，GenBank登陆号为JQ319663。应用BLASTN比对，ClustalX构建Neighbor-Joining树，结果见附图1。由附图1可知，菌株GRLP-25的16SrRNA与已知的植物乳杆菌(L.plantarum)聚在一个分支上，相似性为100%。综合形态特征观察、生理生化试验、分子生物学测序结果，从罗氏沼虾肠道中分离得到的菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌GRLP-25（LactobacillusplantarumGRLP-25）。分离得到的植物乳杆菌GRLP-25，主要有如下几个方面的应用：1.对水产动物病原菌的抑菌作用，尤其是抑制罗氏虾养殖过程中罗氏沼虾致病菌；优选可以抑制水产动物病原菌有罗氏沼虾致病菌阴沟肠杆菌GY52、嗜水气单胞菌SHB1、费氏柠檬酸杆菌GYB8和普通变形杆菌HZL2；2.提高罗氏沼虾免疫功能；作为优选，采用植物乳杆菌GRLP-25的发酵液来提高罗氏沼虾的免疫功能，将发酵液添加入饵料制成药饵喂养罗氏沼虾。3.降低水产养殖水体中氨氮和亚硝酸盐本专利技术提供的植物乳杆菌GRLP-25，可以对水产动物养殖中出现的病原菌具有敏感的抑菌活性，并且能提高水产动物免疫功能，提高动物健康水平，还可以降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的含量，改善养殖生态环境，使养殖生产良性发展，提高水产养殖的产率，取得更好的经济效益和生态效益。附图说明附图1为菌株GRLP-25基于16SrRNA基因序列构建的系统发育树。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术作进一步详细说明。实施例1：植物乳杆菌GRLP-25对水产动物病原菌的抑菌作用1.方法1.1无细胞发酵上清液的制备：将植物乳杆菌GRLP-25活化培养后，以4%接种量接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养到稳定期（24h～36h），12000*g，4℃离心15min，收集上清液，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去菌体及其他杂质即得无菌发酵上清液。置4℃冰箱保存备用。1.2对水产病原菌的抑菌活性试验：本研究以实验室保藏的水产病原菌株嗜水气单胞菌SHB1、BSK-10、罗氏沼虾致病菌阴沟肠杆菌GY52、费氏柠檬酸杆菌GYB8、普通变形杆菌HZL2、副溶血弧菌DHY0708、哈维氏弧菌GYC1108-1、无乳链球菌L4为受试菌株，采用琼脂平板打孔法：在无菌平皿中倒入10ml加热融化的琼脂培养基(适宜受试菌生长)，待其充分冷却凝固后，放入已灭菌的牛津杯数个。取30mlTSA培养基加热融化，待其冷却至50℃左右，接入0.15μl过夜培养的受试菌菌液，迅速混合均匀，倒入平皿。冷却后，无菌镊子取出牛津杯。无菌操作下吸取200μl待测上清样品加入牛津杯孔中，30℃培养24h，测定抑菌圈直径（mm）。2.结果如表2所示，植物乳杆菌所产细菌素对罗氏沼虾致病菌阴沟肠杆菌GY52、费氏柠檬酸杆菌GYB8H、普通变形杆菌HZL2、嗜水气单孢菌SHB1以及水产病原菌气单胞菌BSK-10都具有敏感的抑菌活性，对副溶血弧菌和哈维氏弧菌也具有较强的抑菌活性，对无乳链球菌L4的抑菌活性较弱。表2植物乳杆菌GRLP-25所产细菌素的抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物乳杆菌，名称为植物乳杆菌GRLP‑25，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年4月18 日，保藏编号为CCTCC NO：M 2016197。

【技术特征摘要】
1.一种植物乳杆菌，名称为植物乳杆菌GRLP-25，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年4月18日，保藏编号为CCTCCNO：M2016197。2.根据权利要求1所述一种植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌是从罗氏沼虾肠道中分离得到。3.如权利要求1所述一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，用于水产动物病原菌的抑菌作用。4.根据权利要求3所述一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，用于抑制罗氏沼虾致病菌。5.根据权利要求3所述一种植物乳杆菌的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈锦玉，姚嘉赟，徐洋，袁雪梅，尹文林，潘晓艺，蔺凌云，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33