一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法技术

本发明专利技术涉及多肽领域，特别涉及一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法。本发明专利技术的方法使用一种新的特殊的固定相填料色谱柱，以表面带正电荷的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。该类型色谱柱具有更高的选择性与灵敏度，以及较低的载碳量，在特定的色谱条件下，可以更准确有效地测定利拉鲁肽中有关物质的含量。本发明专利技术提供的检测方法主峰与前后杂质之间的分离度、理论塔板数和拖尾因子均可以满足方法要求。

A high performance liquid chromatographic method for the analysis of polypeptide related substances

The present invention relates to the field of polypeptides, in particular to a high performance liquid chromatographic method for the analysis of polypeptide related substances. The method of the present invention uses a new special stationary phase packed chromatographic column with a positively charged eighteen alkyl silane bonded silica gel as a filler. This type of column has higher sensitivity and selectivity, and low carbon content, in the given chromatographic conditions, can be more accurate and effective determination of related substances in liraglutide. The separation degree between the main peak and the front and rear impurities, the theoretical plate number and the tailing factor can meet the requirements of the method.

【技术实现步骤摘要】
一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法
本专利技术涉及多肽领域，特别涉及一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法。
技术介绍
利拉鲁肽，是一种长效治疗2型糖尿病的胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物。GLP-1是人体内存在的一种生理性多肽，它能够根据体内葡萄糖水平高低，按需促进胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰岛素拮抗激素胰高血糖素的分泌，从而发挥降糖作用。然而，人体产生的GLP-1很不稳定，很快就会被体内的二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，因此若使用天然GLP-1降低血糖，需持续静脉输注或持续皮下注射。利拉鲁肽是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有97％的序列同源性，人GLP-1可以结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。与天然GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射给药后，其作用时间延长的机理包括：使吸收减慢的自联作用；与白蛋白结合；对二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性内肽酶(NEP)具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。利拉鲁肽的活性由其与GLP-1受体间特定的相互作用介导，导致环磷酸腺苷(cAMP)的增加。利拉鲁肽能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌，同时以葡萄糖浓度依赖的模式降低过高的胰高糖素的分泌。因此，当血糖升高时，胰岛素分泌受到刺激，同时胰高糖素分泌受到抑制。化学合成的利拉鲁肽为31肽，分子式为C172H265N43O51，分子量为3751.20。外观为白色至类白色粉末或疏松块状物，有引湿性；几乎不溶于水。其结构式如式I所示：式I化学合成的利拉鲁肽在合成工艺中，难免引入一系列的杂质，如异构体杂质、缺损肽杂质等，这些杂质统称为有关物质，其存在将严重影响利拉鲁肽的产品质量。由于这些有关物质杂质毒性数据不明确，对于患者用药必然存在一定的潜在风险。因此，为了保证利拉鲁肽产品质量，提高患者用药安全性，对利拉鲁肽有关物质进行严格的质量控制具有非常重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法。本专利技术提供一种利拉鲁肽有关物质的高效液相色谱分析方法。本专利技术的方法中，使用了一种新的特殊的固定相填料色谱柱，以表面带正电荷的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。该类型色谱柱具有更高的选择性与灵敏度，以及较低的载碳量，在特定的色谱条件下，可以更准确有效地测定利拉鲁肽中有关物质的含量。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法，其流动相A为0.03％(v/v)～0.3％(v/v)三氟乙酸水溶液；流动相B中水、乙腈、甲醇、三氟乙酸的体积比为(100～200)：(25～100)：(600～900)：(0.1～1)。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的流动相A为0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液；流动相B中水、乙腈、甲醇、三氟乙酸的体积比为150：50：800：0.6。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的柱温为25～50℃。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的柱温为35℃。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的流速为0.3～1.0mLl/min。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的流速为0.5mLl/min。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的洗脱梯度为：在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的洗脱梯度为：在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的色谱柱为CORTECSC18+150mm×4.6mm，2.7μm。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的色谱仪为ACQUITYI-CLASS(Waters)。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法中所述多肽为利拉鲁肽。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱分析方法的检测波长为210nm。本专利技术的方法中，使用了一种新的特殊的固定相填料色谱柱，以表面带正电荷的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。该类型色谱柱具有更高的选择性与灵敏度，以及较低的载碳量，在特定的色谱条件下，可以更准确有效地测定利拉鲁肽中有关物质的含量。进一步的，本专利技术还研究了流动相A、流动相B、柱温、流速和洗脱梯度对结果的影响。由实施例3的实验表明，柱温3中主峰与前杂的分离度最大；所有柱温中主峰与后杂的分离度均符合分离要求；柱温1和柱温2中理论塔板数较大；所有柱温中拖尾因子基本一致；柱温2和柱温3分离出的杂质个数最多。综上所述，柱温2的仪器系统参数最好，因此，选择35℃作为本方法的柱温。由实施例4的实验表明，流速3中主峰与前杂的分离度最大；流速3中主峰与后杂的分离度最大；流速1中理论塔板数最大；所有流速中拖尾因子基本相同；所有流速分离出的杂质个数相同。综上所述，流速3的仪器系统参数最好，因此，选择0.5ml/min作为本方法的流速。由实施例5的实验表明，浓度1、浓度2、浓度3的流动相A中主峰与前杂的分离度基本相同；所有浓度的流动相A中主峰与后杂的分离度均符合分离要求；所有浓度的流动相A中理论塔板数基本相同；浓度1与浓度2的流动相A中拖尾因子大于浓度3与浓度4；浓度2的流动相A中所检出的杂质个数最多。综上所述，浓度2的流动相A的仪器系统参数最好，因此，选择0.05％的三氟乙酸水溶液作为本方法的流动相A。由实施例6的实验表明，组分4的流动相B中主峰与前杂的分离度最大；所有组分的流动相B中主峰与后杂的分离度均符合分离要求；组分1的流动相B中理论塔板数最大；组分1的流动相B中拖尾因子最小；组分1的流动相B中所检出的杂质个数最多。综上所述，组分1的流动相B的仪器系统参数最好，因此，选择水-乙腈-甲醇-三氟乙酸＝150：50：800：0.6(体积比)作为本方法的流动相B。综合上述最优条件，由实施例7的试验结果可知，本专利技术提供的检测方法主峰与前后杂质之间的分离度、理论塔板数和拖尾因子均可以满足方法要求。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1中仪器1的谱图；图2示实施例1中仪器2的谱图；图3示实施例2中色谱柱1的谱图；图4示实施例2中色谱柱2的谱图；图5示实施例2中色谱柱3的谱图；图6示实施例3中柱温1的谱图；图7示实施例3中柱温2的谱图；图8示实施例3中柱温3的谱图；图9示实施例3中柱温4的谱图；图10示实施例4中流速1的谱图；图11示实施例4中流速2的谱图；图12示实施例4中流速3的谱图；图13示实施例5中流动相A浓度1的谱图；图14示实施例5中流动相A浓度2的谱图；图15示实施例5中流动相A浓度3的谱图；图16示实施例5中流动相A浓度4的谱图；图17示实施例6中流动相B组分1的谱图；图18示实施例6中流动相B组分2的谱图；图19示实施例6中流动相B组分3的谱图；图20示实施例6中流动相B组分4的谱图；图21示实施例6中流动相B组分5的谱图；图22示实施例7色谱图；图23示对比例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于，其流动相A为0.03％(v/v)～0.3％(v/v)三氟乙酸水溶液；流动相B中水、乙腈、甲醇、三氟乙酸的体积比为(100～200)：(25～100)：(600～900)：(0.1～1)。

【技术特征摘要】
1.一种多肽有关物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于，其流动相A为0.03％(v/v)～0.3％(v/v)三氟乙酸水溶液；流动相B中水、乙腈、甲醇、三氟乙酸的体积比为(100～200)：(25～100)：(600～900)：(0.1～1)。2.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，其流动相A为0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液；流动相B中水、乙腈、甲醇、三氟乙酸的体积比为150：50：800：0.6。3.根据权利要求1或2所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，其柱温为25～50℃。4.根据权利要求1至3任一项所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，其柱温为35℃。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雷，唐洋明，陶安进，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44