一种使用液相色谱双分子层固定相的方法技术

本发明专利技术涉及一种液相色谱提高分离生物物质使用寿命并且降低分离生物物质样品准备时间和要求的方法。本发明专利技术通过对固定相表面进行一系列化学修饰，将通过聚合物稳定的双分子层加入到固定相表面上，这种双分子层不会与生物质例如蛋白质产生非特异性结合，故极大降低了固定相被结构复杂的大分子蛋白质污染吸附的风险。

【技术实现步骤摘要】
一种使用液相色谱双分子层固定相的方法
本专利技术属于液相色谱领域，主要涉及对液相色谱方法上的改进，包括提高色谱柱填料(固定相)的耐受能力，减少对样品预处理的要求以达到节约时间增快检测速度的目的，同时还降低了对色谱柱前的保护柱的更换频率。
技术介绍
使用液相色谱分离蛋白质，尤其是反相液相色谱，已经有诸多例子。然而由于蛋白质分子结构复杂，组成各异，一般成功的分离都需要前期进行大量的尝试：例如对固定相的选择、移动相的选择，对移动相浓度配比进行优化。除此之外，对待分离蛋白质进行提纯的准备工作是必不可少的。由于蛋白质属于大分子，很可能与固定相发生非特异性结合，导致固定相受到“污染”，甚至导致残留的蛋白质影响分离。一般的色谱柱都会首先对样品进行预处理，并通过保护柱去除部分污染物，然而有些蛋白质是研究者感兴趣的组分不应该被去除，这种方法无疑与研究目的相悖。若不进行这些保护工作，则可能导致保护柱或者色谱柱的使用寿命降低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种无论是极性还是非极性固定相都可以尽量避免蛋白质非特异性结合带来的污染，并且降低对样品预处理的要求，并且提高色谱柱、保护柱的使用寿命的方法。本专利技术解决上述问题包括以下方法：-制备固定相；-使固定相与偶联剂反应，活化固定相表面；-选择两性物质(X)及其亲水端被修饰的对等物(Y，即将X修饰后的两性物质)，Y可与活化的固定相表面反应固定；-根据需要选择对固定相表面进行修饰的极性或者非极性物质(Z，类似于反相色谱固定相的非极性C18)，并且根据需要得出Y与Z的比例，将Y与Z作为反应物与活化的固定相反应。-再加入X，形成双分子层。-根据稳定性的需要可视情况，在形成了双分子层的固定相颗粒的水混合物中加入甲基丙烯酸酯类的单体，混合充分后进行聚合反应，是双分子层更加稳定。-将修饰后的固定相填入到色谱柱中；-按照常规方式得出使用色谱柱分离的方法，例如确定流动相、流速等参数。-可选的，使用单体，例如甲基丙烯酸酯，聚合式双分子层更稳定。作为优选的实施例，(1)中固定相可以选择二氧化硅、二氧化钛等常规液相色谱固定相颗粒。作为优选的实施例，(2)中所述两性物质是一端亲油，另一端亲水的分子，并且该物质形成双分子层。作为优选的实施例，(2)中的两性物质可以由下式表示：其中A为Va族元素，例如P，As，Bi；Q为氧族元素，选自：S，Se，Te，O；R2，R3相互独立地为6-20碳原子的烃基，R1为含碳数为0-2的亚烷基，R4，R5，R6是各自独立的烃基或氢原子，含碳数为0-3，氮原子电荷随其连接烃基数量而变化。其中优选，A为磷，Q为氧，R4为甲基，R5，R6为氢原子，R1含碳数为2的亚烷基；作为优选的实施例，(I)的与氮原子相连的基团可以被进一步修饰，修饰后的两性物质(Y)可以与硅偶联剂反应。作为优选的实施例，选择二氧化硅颗粒作为固定相，使用偶联剂活化其表面，使其可以与其他试剂反应。硅偶联剂对二氧化硅表面的反应是公知常识，反应条件以及需要硅偶联剂提供的反应基团都已属于现有技术，可以根据需要选择，例如可使用γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，此时Y中的反应性基团可以为羧基，而需要提供表面极性的基团，例如反相色谱的C18，也可选择含有羧基的基团。作为优选的实施例，根据所需固定相的极性，例如反相色谱，使用C18固定相(由于Y本身的碳链长度，优选使用含碳数为20-80的脂肪酸)，加入固定相表面极性试剂(Z)，此时可以按照比例加入两性物质(Y)，Y与Z的比例完全取决于使用色谱的人员所需要的固定相极性，没有特别的限制。作为优选的实施例，按照上面所述方法先将二氧化硅表面进行偶联剂活化，再加入所需物质Y和Z反应，达到对二氧化硅表面的基本覆盖，随后加入未经修饰的物质X，由于XY结构相同，形成双分子层。将二氧化硅过滤或者离心分离，用清水缓慢清洗3-5次后待用。作为更优选的实施例，为了进一步增强双分子层的稳定性，向清洗后的二氧化硅中加入二甲基丙烯酸乙二醇酯和甲基丙烯酸酯，再搅拌的情况下，加入引发剂AIBN，在紫外光照射下进行交联聚合。由于二甲基丙烯酸乙二醇酯和甲基丙烯酸酯可以扩散到双分子成的厌水区，因此聚合物形成的聚合物网络将双分子层锁紧，使其结构变得更稳定。一般情况下，若不进行聚合，向溶液中加入其他表面活性剂将导致双分子层瓦解，使得二氧化硅表面修饰失效，这可以从光散射实验得到证实，加入表面活性剂后出现许多小的胶束micelle导致的峰，而聚合后不会出现这种情况。经过聚合后的二氧化硅经过离心清水洗涤干燥后，可以填入液相色谱中作为固定相。本专利技术的有益效果：(1)使用双分子层可以有效避免复杂结构的蛋白质对固定相、保护柱的侵蚀和干扰；(2)该双分子层经过聚合后提供稳定、长久的对固定相的保护，增加其分离蛋白质的使用寿命；(3)双分子层的覆盖比例和提供固定相分离效力的基团完全可以根据需要进行调整，使用者可以根据实际情况需要而做出调整，非常灵活；(4)本专利技术的实施方式还可以减少对样本处理的时间和要求，因为本专利技术提供的双分子层可以有效避免蛋白质的非特异性结合，因为形成该双分子层的物质本身就是构成生物细胞膜的一种，不会引发蛋白质聚积和非特异性结合。附图说明附图图1：1-固定相，二氧化硅颗粒；2-双分子层；3-做为分离所需的固定相基团，可以为亲水或者亲油，根据需要确定种类和覆盖率。1与2、3之间通过偶联剂发生偶联连接，其化学键未显示。附图图2：被聚合物锁牢稳定的双分子层具体实施方式选择二氧化硅颗粒作为固定相，无水溶剂洗涤，干燥后，将其放入到有机溶剂中，有机溶剂优选不含水分(可使用甲苯)，加入可与修饰后的两性物质(Y)反应的硅偶联剂(ATPS)：二氧化硅表面形成氨基。反应完毕后，离心分离出表面经过活化的二氧化硅，干燥后与Y和脂肪酸反应(所用脂肪酸为含42碳原子的直链羧酸)，在加热条件下在有机溶剂中反应，形成酰胺键将两性物质和非极性基团修饰到二氧化硅表面，离心洗净干燥后，与未经修饰的两性物质(X)在有机溶剂中混合，该溶剂优选氯仿，均匀混合后，使用惰性气体作为氛围干燥。所述Y为16:0GlutarylPE:1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(glutaryl)(sodiumsalt)870245，来自于AVANTIPolarLipids；所述X的R4为甲基，R5，R6为氢原子，X其他结构与Y相同。向干燥后的混合物中加入去离子水，放置在密封的容器中。准备好水浴，温度在40-60摄氏度，准备好干冰与异丙醇的混合物作为冰浴，经过在水浴冰浴中进行多轮交替变温后将其冷却至室温，离心分离二氧化硅固体，用清水缓慢洗涤固体二氧化硅3-5次。此时得到了表面具有双分子层的二氧化硅固定相。向上述溶液加入二甲基丙烯酸乙二醇酯和甲基丙烯酸酯，充分混合。向上述混合物中加入AIBN引发剂，充分混合30分钟，在紫外线照射下反应30分钟，然后采用过滤、离心等方式分离洗净，得到固定相二氧化硅。通过XPS表面分析得到的P，N含量可知，固相二氧化硅已经被成功修饰为双分子层表面，且经过大量表面活性剂清洗后，溶液中未检测到P，N元素，说明该双分子层非常稳定，这是因为一般的双分子层形成后会被表面活性剂破坏成为胶束本文档来自技高网...

【技术保护点】
‑一种使用液相色谱的方法，其特征在于包括以下步骤：‑在其固定相表面使用偶联剂活化；‑选择可形成双分子层的两性物质X，将其亲水端改性使亲水端可与偶联剂活化后的固定相表面反应形成化学键，改性后的两性物质为Y；‑根据所要分离物质的极性选择决定固定相表面性质的固定相表面修饰剂Z，该修饰剂含有可以与偶联剂活化的固定相表面形成化学键的基团；‑根据需要将Y，Z按比例混合与固定相反应，使Y，Z覆盖固定相表面；‑加入两性物质X，使X，Y形成双分子层；‑向含有双分子层的固定相水分散液加入可聚合的单体，充分扩散混合后，进行聚合反应，分离固定相颗粒后得到结构稳定的含有双分子层的固定相。

【技术特征摘要】
1.一种使用液相色谱的方法，其特征在于包括以下步骤：在其固定相表面使用偶联剂活化；选择可形成双分子层的两性物质X，将其亲水端改性使亲水端可与偶联剂活化后的固定相表面反应形成化学键，改性后的两性物质为Y；根据所要分离物质的极性选择决定固定相表面性质的固定相表面修饰剂Z，该修饰剂含有可以与偶联剂活化的固定相表面形成化学键的基团；根据需要将Y，Z按比例混合与固定相反应，使Y，Z覆盖固定相表面；加入两性物质X，使X，Y形成双分子层；向含有双分子层的固定相水分散液加入可聚合的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭波，许爱华，隋峰，林振强，孙倩芸，何云馨，许思思，李锋丽，
申请(专利权)人：山东省计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37