使用质谱检测至少一种碳青霉烯抗性机制的方法技术

本发明专利技术涉及通过质谱检测样品中至少一种微生物针对至少一种抗菌剂的至少一种抗性标记的方法，其特征在于抗菌剂是碳青霉烯，且所述抗性标记是蛋白质或肽。优选地，所述蛋白质或肽是来自所述微生物的蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
使用质谱检测至少一种碳青霉烯抗性机制的方法本申请是申请日为2012年4月20日的第201280030179.4号专利技术名称为“使用质谱检测至少一种碳青霉烯抗性机制的方法”的中国专利申请的分案申请。本专利技术涉及微生物学领域。更精确地说，本专利技术涉及用质谱检测样品中至少一种微生物对碳青霉烯抗性的至少一种机制的方法。自从巴斯德发现了微生物以来，微生物体以显微镜和生化分析来研究。这些传统的方法通常冗长乏味，因此很久以来一直在寻找其他分析方法。这就是为什么J.Anhalt和C.Fenselau从1975年起发起了以质谱分析细菌[1]。随着这一初步工作，气相色谱与质谱联用的方法被用于微生物细胞壁中脂肪酸的研究[2]。这项技术广泛采用的英语术语是FAME，即脂肪酸甲酯(FattyAcidMethylEster)。现在成为一种分类学研究的参考方法。尽管如此，它的应用局限于某些特定的以皂化、水解和分离的方法处理样品的实验室。在1996年，M.Claydon等[3]以及T.Krishnamurthy和P.Ross[4]的工作证明可以用MALDI-TOF(矩阵辅助的激光解吸离子化-渡越时间，MatrixAssistedLaserDesorptionIonization–TimeOfFlight)质谱鉴别不同的细菌种。该分析结合了获取质谱和解释专业软件。十分简单并且可以在几分钟内得出结果。尽管如此，现在还只是应用在药物分析的实验室[5]。其临床应用现在还局限于鉴别细菌和酵母的种类，还没有常规应用于鉴别抗菌剂抗性。为了保证最优化的病患护理，对诸如抗生素等抗菌剂的抗性的鉴别是重要的要素。推荐其他质谱方法，特别是串联质谱，以满足这些需要。例如，可以引用C.Fenselau等关于用四极子-TOF(Q-TOF)鉴别β-内酰胺酶的工作[6]。尽管如此，这些研究结果是通过通过研究仪器获得的，要求高素质的人员，无法应用于日常临床。通常大于1小时/样品的分析时间与微生物分析实验室的工作量是不相容的。最近，S.Hofstadler等[7]提出了一种结合PCR扩增微生物基因组和电喷射-TOF(ESI-TOF)检测PCR产物的方法。这种方法现在是全自动的[8]。尽管如此，它要求PCR扩增，其具有分子生物学固有的瑕疵，即提取产量，探针成本等问题。在这一背景下，本专利技术的目的在于提出一种检测碳青霉烯抗性机制的方法，以克服现有技术的不足，也就是提供一种廉价的方法，特别是与分子生物学相比，不使用每个种特异的试剂，在短时间内(少于1小时)得出结果，不要求高素质人员而能够应用于日常临床。为了这个目的，本专利技术提出了一种通过质谱检测样品中至少一种微生物对至少一种抗菌剂的至少一种抗性机制的新方法，其特征在于：抗菌剂是碳青霉烯；以及检测针对至少一类碳青霉烯抗生素的所述抗性机制的标记是蛋白质和/或多肽。优选地，抗性标记是来自于所述至少一种微生物的蛋白质。有利的是，几种不同抗菌剂的抗性标记可以同时检测。如PCT/FR2010/052181中所示，在检测抗性机制标记之前或同时，所述微生物的类型和/或毒力标记能够通过质谱以相同的方法检测。至少一种碳青霉烯类抗菌剂的抗性标记理解为以所述性质为特征的蛋白质来源的分子。碳青霉烯是属于β-内酰胺家族的抗生素，其主要代表是亚胺培南、美罗培南、厄他培南和多利培南。这些分子被Bush和Jacoby分类的β-内酰胺酶2df、2f和3a分解([9]，AntimicrobialAgentsandChemotherapy,2010；54(3):969-976)。确定对至少一种抗菌剂的抗性理解为确定微生物被抗菌剂杀死的敏感性。当科和种不同时抗性机制涉及的蛋白也将不同。β-内酰胺酶——β-内酰胺抗性细菌酶——的命名法未标准化。既根据一级结构分为四类(A到D)，也按照靶底物和对抑制剂的抗性功能性分组(作为概述，见前述BushandJacoby[9])。对分子分类，测序技术使更精确的分类成为可能：例如，已经描述了TEM蛋白的183种变体(标记为TEM-i，i从1到183)。对于功能性分类，前述BushandJacoby提出了新的功能性亚组：-第一组酶是属于C类分子的头孢菌素酶。CMY和FOX是质粒携带的酶，属于这个亚组。-第二组酶属于A类和D类分子。这个组自我再分为亚组2b、2be、2br、2ber、2d、2de、2df、2f等。CTX-M(2be)和TEM(包括2be、2br)是属于这个亚组的酶。2b亚组对应被克拉维酸、sulfobactam或三唑巴坦抑制的广谱的β-内酰胺酶。2be亚组对应同样也被克拉维酸、sulfobactam或三唑巴坦抑制的超广谱的β-内酰胺酶(ESBL)。2br亚组对应2b亚组中对克拉维酸、sulfobactam或三唑巴坦的抑制不敏感的β-内酰胺酶。2bf亚组包括对碳青霉烯超广谱的OXA。2f组对应碳青霉烯酶β-内酰胺酶，例如KPC。-第三组包含水解碳青霉烯的金属-β-内酰胺酶，例如IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、AIM、KHM、DIM或NDM。NDM-1β-内酰胺酶于2010年被描述(Kumarasamyetal.,2010,LancetInfect.Dis.,10:597-602)。相当于一种金属-β-内酰胺酶，赋予对除氨曲南外所有β-内酰胺的抗性。KPCβ-内酰胺酶于2001年在美国被描述(Yigitetal.,2001,Antimicrobio.AgentsChemother.,45:1151-1161)，随后遍及世界。相当于A类β-内酰胺酶，赋予对头孢菌素和碳青霉烯的抗性，尤其是对亚胺培南和美罗培南。IMPβ-内酰胺酶于1994年在日本被描述(Osanoetal.,1994,Antimicrobio.AgentsChemother.,38:71-78)，随后遍及世界。相当于金属-β-内酰胺酶，赋予对头孢菌素和碳青霉烯的抗性，但是对替莫西林和氨曲南无效。VIMβ-内酰胺酶与1999年在欧洲被描述(Laurettietal.,1999,Antimicrobio.AgentsChemother.,43:1584-1590)，随后遍及世界。相当于金属-β-内酰胺酶，赋予对头孢菌素和碳青霉烯的抗性，但是对氨曲南无效。第一个GESβ-内酰胺酶与1998年在法属圭亚那被分离(Poireletal.,2000,Antimicrobio.AgentsChemother.,43:622-632)。这种酶(GES-1)赋予ESBL抗性。从耐受GESβ-内酰胺酶的细菌的第二次分离于2000年在南非完成(Poireletal.,2001,Antimicrobio.AgentsChemother.,45:2598-2603)。这种酶(GES-2)赋予对诸如亚胺培南的头孢菌素和碳青霉烯的抗性。INDβ-内酰胺酶首次描述于1999年(Bellaisetal.,1999,FEMSMicrobio.Lett.,171:127-132)。相当于金属-β-内酰胺酶，赋予对头孢菌素和碳青霉烯的抗性。SMEβ-内酰胺酶首次描述于1994年(Naasetal.,1994,Antimicrobio.AgentsChemother.,38:1262-12本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过多反应监测模式下串联型质谱检测样品中至少一种微生物针对至少一种抗菌剂碳青霉烯的至少一种抗性标记的方法，其中所述至少一种抗性标记是OXA肽，所述OXA肽选自由以下氨基酸序列的肽组成的组：SEQ ID No.509到SEQ ID No.523、SEQ ID No.525到SEQ ID No.572、SEQ ID No.574到SEQ ID No.604、SEQ ID No.606到SEQ ID No.618、SEQ ID No.620到SEQ ID No.696、SEQ ID No.698到SEQ ID No.1077以及SEQ ID No.1098到SEQ ID No.1109。

【技术特征摘要】
2011.04.21 US 61/477,9151.一种通过多反应监测模式下串联型质谱检测样品中至少一种微生物针对至少一种抗菌剂碳青霉烯的至少一种抗性标记的方法，其中所述至少一种抗性标记是OXA肽，所述OXA肽选自由以下氨基酸序列的肽组成的组：SEQIDNo.509到SEQIDNo.523、SEQIDNo.525到SEQIDNo.572、SEQIDNo.574到SEQIDNo.604、SEQIDNo.606到SEQIDNo.618、SEQIDNo.620到SEQIDNo.696、SEQIDNo.698到SEQIDNo.1077以及SEQIDNo.1098到SEQIDNo.1109。2.权利要求1的检测方法，其中所述抗性标记是来源于所述至少一种微生物的蛋白质。3.权利要求2的检测方法，其中来源于所述微生物的蛋白质被消化成肽。4.权利要求3的检测方法，其中用酶进行所述消化。5.权利要求4的检测方法，其中所述酶是胰蛋白酶。6.权利要求1的检测方法，其中所述抗性标记进一步包括至少一种选自NDM、GES、IMP、IND、SME和VIM型的蛋白质或肽。7.权利要求6的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQIDNo.2到SEQIDNo.9以及SEQIDNo.1083的肽的NDM肽。8.权利要求7的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5或SEQIDNo.7的肽的NDM标记。9.权利要求1的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQIDNo.509、SEQIDNo.510、SEQIDNo.512、SEQIDNo.513、SEQIDNo.514、SEQIDNo.515、SEQIDNo.516、SEQIDNo.517、SEQIDNo.518、SEQIDNo.519、SEQIDNo.520、SEQIDNo.521、SEQIDNo.522、SEQIDNo.523、SEQIDNo.525、SEQIDNo.526、SEQIDNo.528、SEQIDNo.530、SEQIDNo.531、SEQIDNo.532、SEQIDNo.533、SEQIDNo.534、SEQIDNo.535、SEQIDNo.536、SEQIDNo.537、SEQIDNo.538、SEQIDNo.539、SEQIDNo.540、SEQIDNo.541、SEQIDNo.542、SEQIDNo.543、SEQIDNo.544、SEQIDNo.545、SEQIDNo.546、SEQIDNo.547、SEQIDNo.548、SEQIDNo.549、SEQIDNo.550、SEQIDNo.551、SEQIDNo.552、SEQIDNo.553、SEQIDNo.554、SEQIDNo.555、SEQIDNo.556、SEQIDNo.557、SEQIDNo.558、SEQIDNo.559、SEQIDNo.560、SEQIDNo.561、SEQIDNo.562、SEQIDNo.563、SEQIDNo.564、SEQIDNo.565、SEQIDNo.566、SEQIDNo.567、SEQIDNo.571、SEQIDNo.572、SEQIDNo.574、SEQIDNo.575、SEQIDNo.576、SEQIDNo.577、SEQIDNo.578、SEQIDNo.580、SEQIDNo.581、SEQIDNo.583、SEQIDNo.584、SEQIDNo.586、SEQIDNo.587、SEQIDNo.588、SEQIDNo.589、SEQIDNo.590、SEQIDNo.591、SEQIDNo.593、SEQIDNo.594、SEQIDNo.595、SEQIDNo.596、SEQIDNo.597、SEQIDNo.598、SEQIDNo.599、SEQIDNo.600、SEQIDNo.601、SEQIDNo.602、SEQIDNo.604、SEQIDNo.606、SEQIDNo.607、SEQIDNo.609、SEQIDNo.611、SEQIDNo.612、SEQIDNo.613、SEQIDNo.614、SEQIDNo.615、SEQIDNo.616、SEQIDNo.618、SEQIDNo.620、SEQIDNo.622、SEQIDNo.623、SEQIDNo.624、SEQIDNo.625、SEQIDNo.626、SEQIDNo.627、SEQIDNo.632、SEQIDNo.633、SEQIDNo.635、SEQIDNo.636、SEQIDNo.637、SEQIDNo.638、SEQIDNo.639、SEQIDNo.640、SEQIDNo.641、SEQIDNo.642、SEQIDNo.643、SEQIDNo.645、SEQIDNo.648、SEQIDNo.649、SEQIDNo.651、SEQIDNo.652、SEQIDNo.653、SEQIDNo.654、SEQIDNo.655、SEQIDNo.656、SEQIDNo.659、SEQIDNo.660、SEQIDNo.664、SEQIDNo.665、SEQIDNo.666、SEQIDNo.667、SEQIDNo.669、SEQIDNo.670、SEQIDNo.672、SEQIDNo.673、SEQIDNo.674、SEQIDNo.675、SEQIDNo.676、SEQIDNo.677、SEQIDNo.678、SEQIDNo.679、SEQIDNo.680、SEQIDNo.681、SEQIDNo.685、SEQIDNo.686、SEQIDNo.687、SEQIDNo.688、SEQIDNo.689、SEQIDNo.690、SEQIDNo.691、SEQIDNo.692、SEQIDNo.693、SEQIDNo.694、SEQIDNo.696、SEQIDNo.698、SEQIDNo.699、SEQIDNo.700、SEQIDNo.701、SEQIDNo.702、SEQIDNo.703、SEQIDNo.706、SEQIDNo.707、SEQIDNo.710、SEQIDNo.714、SEQIDNo.717、SEQIDNo.719、SEQIDNo.720、SEQIDNo.722、SEQIDNo.725、SEQIDNo.726、SEQIDNo.727、SEQIDNo.728、SEQIDNo.729、SEQIDNo.732、SEQIDNo.735、SEQIDNo.736、SEQIDNo.737、SEQIDNo.738、SEQIDNo.740、SEQIDNo.741、SEQIDNo.743、SEQIDNo.744、SEQIDNo.745、SEQIDNo.746、SEQIDNo.747、SEQIDNo.748、SEQIDNo.749、SEQIDNo.750、SEQIDNo.751、SEQIDNo.752、SEQIDNo.753、SEQIDNo.754、SEQIDNo.755、SEQIDNo.756、SEQIDNo.757、SEQIDNo.759、SEQIDNo.760、SEQIDNo.762、SEQIDNo.763、SEQIDNo.766、SEQIDNo.767、SEQIDNo.768、SEQIDNo.769、SEQIDNo.770、SEQIDNo.771、SEQIDNo.773、SEQIDNo.774、SEQIDNo.775、SEQIDNo.776、SEQIDNo.777、SEQIDNo.778、SEQIDNo.779、SEQIDNo.780、SEQIDNo.781、SEQIDNo.782、SEQIDNo.783、SEQIDNo.785、SEQIDNo.786、SEQIDNo.787、SEQIDNo.788、SEQIDNo.789、SEQIDNo.790、SEQIDNo.792、SEQIDNo.793、SEQIDNo.794、SEQIDNo.795、SEQIDNo.796、SEQIDNo.797、SEQIDNo.798、SEQIDNo.799、SEQIDNo.800、SEQIDNo.801、SEQIDNo.803、SEQIDNo.804、SEQIDNo.805、SEQIDNo.806、SEQIDNo.807、SEQIDNo.809、SEQIDNo.810、SEQIDNo.811、SEQIDNo.812、SEQIDNo.813、SEQIDNo.814、SEQIDNo.815、SEQIDNo.818、SEQIDNo.821、SEQIDNo.822、SEQIDNo.824、SEQIDNo.825、SEQIDNo.826、SEQIDNo.827、SEQIDNo.828、SEQIDNo.829、SEQIDNo.830、SEQIDNo.831、SEQIDNo.832、SEQIDNo.833、SEQIDNo.834、SEQIDNo.835、SEQIDNo.836、SEQIDNo.837、SEQIDNo.838、SEQIDNo.840、SEQIDNo.841、SEQIDNo.842、SEQIDNo.844、SEQIDNo.845、SEQIDNo.846、SEQIDNo.847、SEQIDNo.848、SEQIDNo.849、SEQIDNo.850、SEQIDNo.851、SEQIDNo.853、SEQIDNo.854、SEQIDNo.855、SEQIDNo.856、SEQIDNo.857、SEQIDNo.858、SEQIDNo.859、SEQIDNo.860、SEQIDNo.861、SEQIDNo.862、SEQIDNo.865、SEQIDNo.866、SEQIDNo.867、SEQIDNo.868、SEQIDNo.869、SEQIDNo.871、SEQIDNo.874、SEQIDNo.875、SEQIDNo.876、SEQIDNo.877、SEQIDNo.878、SEQIDNo.879、SEQIDNo.880、SEQIDNo.881、SEQIDNo.882、SEQIDNo.883、SEQIDNo.884、SEQIDNo.885、SEQIDNo.886、SEQIDNo.887、SEQIDNo.888、SEQIDNo.889、SEQIDNo.890、SEQIDNo.891、SEQIDNo.892、SEQIDNo.893、SEQIDNo.894、SEQIDNo.895、SEQIDNo.896、SEQIDNo.897、SEQIDNo.898、SEQIDNo.899、SEQIDNo.900、SEQIDNo.901、SEQIDNo.902、SEQIDNo.903、SEQIDNo.904、SEQIDNo.905、SEQIDNo.906、SEQIDNo.907、SEQIDNo.908、SEQIDNo.909、SEQIDNo.910、SEQIDNo.912、SEQIDNo.913、SEQIDNo.914、SEQIDNo.918、SEQIDNo.920、SEQIDNo.921、SEQIDNo.922、SEQIDNo.923、SEQIDNo.928、SEQIDNo.930、SEQIDNo.932、SEQIDNo.935、SEQIDNo.936、SEQIDNo.937、SEQIDNo.938、SEQIDNo.939、SEQIDNo.940、SEQIDNo.941、SEQIDNo.942、SEQIDNo.943、SEQIDNo.944、SEQIDNo.945、SEQIDNo.946、SEQIDNo.947、SEQIDNo.948、SEQIDNo.949、SEQIDNo.950、SEQIDNo.951、SEQIDNo.953、SEQIDNo.954、SEQIDNo.955、SEQIDNo.956、SEQIDNo.958、SEQIDNo.961、SEQIDNo.962、SEQIDNo.963、SEQIDNo.964、SEQIDNo.967、SEQIDNo.968、SEQIDNo.970、SEQIDNo.972...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·沙勒捷，JP·沙里耶，C·弗兰切斯基，G·赞巴尔迪，T·切基尼，E·德古沙尔梅特，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：美国,US