一种检测禽白细胞介素2含量的方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测禽白细胞介素2含量的方法及其专用试剂盒。本发明专利技术利用chIL‑2单克隆抗体建立了针对chIL‑2在蛋白水平上的双夹心ELISA检测方法。通过实验证明：本发明专利技术的抗chIL‑2单克隆抗体具有良好的特异性和亲和力，能够准确地反映出血清或细胞上清中chIL‑2的含量，且本发明专利技术的检测方法快捷、高效又准确，解决了现有技术中采用荧光定量PCR检测方法带来的操作繁琐，耗时耗力，易受操作及其他外部条件影响等问题，不仅有助于评价chIL‑2在机体内的动态变化水平，为疾病的预防和治理提供很好的参考，而且有助于了解禽类传染性疾病的发生、发展、转归情况及机体保护性免疫反应的动态。

【技术实现步骤摘要】
一种检测禽白细胞介素2含量的方法及其专用试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测禽白细胞介素2(IL-2)含量的方法及其专用试剂盒。
技术介绍
白细胞介素2(IL-2)是免疫应答所必需的细胞因子，在T细胞生长和分化、B细胞发育及NK细胞激活方面发挥重要的作用。但因为细胞因子含量低，在检测方面一直存在困难。随着单克隆抗体技术的普及，利用单克隆抗体技术建立的免疫检测技术能十分敏捷地检测到细胞因子，大大加速了细胞因子的研究进程。单克隆抗体技术是利用骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖但不能分泌特异性抗体，而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体但在体外不能无限增殖的特性，将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成杂交瘤细胞，使其具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经选择培养基的选择，只有融合的杂交瘤细胞能够存活和增殖，又经过三次亚克隆及间接ELISA方法的筛选，最终获得能分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，经小鼠腹腔内培养，即可无限制地大量获得单克隆抗体。酶联免疫吸附试验(ELISA)是将可溶性抗原或抗体吸附于固相载体上，利用酶标抗体或抗原结合形成酶标记的免疫复合物，加入相应酶底物显色，根据反应液颜色判定抗原抗体反应情况，该方法是将抗原抗体反应特异性与酶促反应的高效性结合起来的实验技术，可用于定性或定量地检测液体中的半抗原、抗原和抗体，在科研和生产中应用广泛。目前不论国内还是国外市场上都还没有能够检测鸡IL-2蛋白的试剂盒，但类似的能够检测人或小鼠血清或细胞上清中IL-2蛋白的试剂盒已经被广泛应用。此外还有大鼠、猴等动物的IL-2检测试剂盒也有所应用。目前对于IL-2的研究主要集中于哺乳动物尤其是人IL-2，而对鸡IL-2的研究还十分有限，鸡IL-2与哺乳动物IL-2有相似的生物学活性。但因为IL-2具有种属特异性，鸡IL-2与哺乳动物IL-2同源性相差较大，无交叉反应性，故目前很多可用于哺乳动物的实验技术及从市面上商品化的检测试剂盒不能用于鸡IL-2的研究，极大的限制了对鸡IL-2的深入研究。现有技术中检测鸡白细胞介素2(IL-2)的变化主要应用的实验技术是荧光定量PCR，荧光定量检测的是mRNA水平的变化，但由于mRNA水平与蛋白水平并不呈绝对的线性关系，所以应用荧光定量PCR并不能反应出鸡IL-2蛋白的实际水平，故其并不能作为一个检测鸡IL-2蛋白量的实验技术而应用，同时荧光定量PCR技术操作繁琐，对专业技能要求较高且价格昂贵，不宜用于生产实际。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供抗chIL-2的单克隆抗体。本专利技术提供的抗chIL-2的单克隆抗体是由保藏号为CGMCCNo.13832的杂交瘤细胞株FM-1和保藏号为CGMCCNo.13833的杂交瘤细胞株FM-2分泌的。将保藏号为CGMCCNo.13832的杂交瘤细胞株FM-1分泌的抗chIL-2的单克隆抗体命名为FM-1抗体，将保藏号为CGMCCNo.13833的杂交瘤细胞株FM-2分泌的抗chIL-2的单克隆抗体命名为FM-2抗体。本专利技术的第二个目的是提供分泌抗chIL-2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术提供的分泌抗chIL-2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株为FM-1和FM-2。杂交瘤细胞株FM-1的分类命名为杂交瘤细胞系(小鼠来源)，该杂交瘤细胞株已于2017年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.13832。杂交瘤细胞株FM-2的分类命名为杂交瘤细胞系(小鼠来源)，该杂交瘤细胞株已于2017年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.13833。本专利技术的第三个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量的酶联免疫试剂盒。本专利技术提供的检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量的酶联免疫试剂盒包括上述FM-1抗体和/或FM-2抗体。上述酶联免疫试剂盒还包括chIL-2标准品；所述chIL-2标准品是通过将核苷酸序列如序列表中序列1所示的chIL-2基因在原核细胞中进行表达获得的。所述酶联免疫试剂盒中还包括如下中的至少一种：酶标板、包被缓冲液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、封闭液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP标记的链霉亲和素)、显色液和终止液。本专利技术的第四个目的是提供上述抗chIL-2的单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株或上述酶联免疫试剂盒的新用途。本专利技术提供了上述抗chIL-2的单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株或上述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量中的应用。上述抗chIL-2的单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株在制备检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量的试剂或胶体金试纸条或试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量的方法。本专利技术提供的检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量的方法是以FM-1抗体为包被抗体、生物素化的FM-2抗体为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法。上述方法检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量的方法具体包括如下步骤：(1)将FM-1抗体包被到酶标板上，洗涤；(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；(3)向(2)得到的酶标板中加入chIL-2标准品或待测样品，孵育，洗涤；(4)向(3)得到的酶标板中加入生物素化的FM-2抗体，孵育，洗涤；(5)向(4)得到的酶标板中加入HRP标记的链霉亲和素，孵育，洗涤；(6)向(5)得到的酶标板中加入底物显色，显色后加入终止液终止反应；(7)用酶标仪检测加入chIL-2标准品的各孔的吸光度值，以chIL-2标准品浓度为横坐标、以酶标仪的读数为纵坐标绘制标准曲线；(8)用酶标仪检测加入待测样品的孔的吸光度值，将吸光度值代入所述标准曲线，即得待测样品中chIL-2的浓度。上述方法中，所述步骤(1)中，用碳酸盐缓冲液将FM-1抗体稀释后包被到酶标板上；所述步骤(2)中，用脱脂奶溶液封闭(1)得到的酶标板；所述步骤(3)中，用BSA溶液将chIL-2标准品稀释后加入酶标板中；所述步骤(4)中，用BSA溶液将生物素化的FM-2抗体稀释至1μg/mL后加入酶标板中。所述生物素化的FM-2抗体的制备方法参照抗体生物素标记试剂盒(购自ThermoScientific，Prod#21440)中说明书中的方法。上述方法中，所述步骤(1)中，所述抗体的浓度稀释为5μg/mL；所述包被的条件为4℃包被12h；所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.05M，pH为9.6；所述步骤(2)中，所述脱脂奶溶液(溶剂为洗涤缓冲液)的质量分数为5％；所述封闭的条件为4℃封闭12h；所述BSA溶液(溶剂为洗涤缓冲液)的质量分数为1％；所述步骤(3)中，所述孵育时间为1h；所述步骤(4)中，所述孵育时间为2h；所述步骤(5)中，所述孵育时间为15min；所述用酶标仪检测吸光度值时的波长为450nm；所述洗涤的次数为3次；所述底物为TM本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗chIL‑2的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.13832的杂交瘤细胞株FM‑1分泌的。

【技术特征摘要】
1.抗chIL-2的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.13832的杂交瘤细胞株FM-1分泌的。2.抗chIL-2的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.13833的杂交瘤细胞株FM-2分泌的。3.一株分泌抗chIL-2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株FM-1，其保藏号为CGMCCNo.13832。4.一株分泌抗chIL-2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株FM-2，其保藏号为CGMCCNo.13833。5.一种检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量的酶联免疫试剂盒，其包括权利要求1所述的单克隆抗体和/或权利要求2所述的单克隆抗体。6.权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株或权利要求5所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量中的应用；或，权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株在制备检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量的试剂或胶体金试纸条或试剂盒中的应用。7.一种检测或辅助检测待测样品中chIL-2含量的方法，是以权利要求1所述的单克隆抗体为包被抗体、权利要求2所述的单克隆抗体为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的单克隆抗体包被到酶标板上，洗涤；(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；(3)向(2)得到的酶标板中加入chIL-2标准品或待测样品，孵育，洗涤；(4)向(3)得到的酶标板中加入生物素化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑世军，付梦娇，王永强，李晓齐，曹红，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11