一种检测病理性近视的筛查试剂盒制造技术

本发明专利技术具体公开了一种检测病理性近视的筛查试剂盒，包括抗体芯片，细胞粘附因子标准品，生物素标记的细胞粘附因子检测抗体混合物；和荧光素Cy5标记的链霉亲和素；所述抗体芯片以含有失水山梨醇酯的亲水试剂处理的硝酸纤维素膜作为固相载体，且细胞粘附因子的特异性抗体在4～20℃、30～35％的湿度条件下点样到固相载体上。本发明专利技术的抗体芯片试剂盒克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测病理性近视的筛查试剂盒
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种检测病理性近视的筛查试剂盒。
技术介绍
病理性近视又称高度近视、变性近视或恶性近视，它是指屈光度在-6.00D以上，并且呈进行性加深、眼轴不断增长、眼内容和视网膜、脉络膜组织进行性损害引起视功能障碍为特征的一种眼病。层粘连蛋白是一种大分子非胶原糖蛋白，广泛存在于各组织的基底膜，主要由内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞及贮脂细胞产生。层粘连蛋白是胚胎发生时期产生最早的蛋白分子之一，主要由上皮细胞，内皮细胞等多种细胞合成和分泌，是一种重要的细胞外基质，在基质各成分之间及细胞之间起到连接作用，广泛存在于全身各组织中，在眼巩膜起到将巩膜层内及各层间胶原纤维和微纤维连结起来的作用，对维持巩膜的组织结构和功能起到重要作用。研究者在动物和人的关于病理性近视和层粘连蛋白的相关性研究中发现，病理性近视的形成与层粘连蛋白在眼球巩膜中的含量降低有关，LAMA1基因是病理性近视家系的致病基因之一。实验性近视动物模型研究表明，高度近视动物眼巩膜中层粘连蛋白减少，Edwards等证实LAMA1基因缺失的小鼠，眼球巩膜中层粘连蛋白减少，表现为眼轴的增长，视力丧失，以及视网膜、玻璃体血管持续性迂曲，从而证实层粘连蛋白在维持正常眼球生理功能中具有重要作用。由此可见，病理性近视的形成与层粘连蛋白的相关性表现在:LAMA1基因发生突变或表达异常导致层粘连蛋白的合成、分布、结构和功能异常，导致眼球巩膜生物力学的改变，最终导致眼轴变长及其相关的并发症。因此，可以开发一种依据层粘连蛋白含量而诊断病理性近视的试剂盒。专利
技术实现思路
针对现有技术的上述不足，本专利技术提供一种检测病理性近视的筛查试剂盒，以解决上述的技术问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种检测病理性近视的筛查试剂盒，包括抗体芯片，细胞粘附因子标准品，生物素标记的细胞粘附因子检测抗体混合物；和荧光素Cy5标记的链霉亲和素；所述抗体芯片以含有失水山梨醇酯的亲水试剂处理的硝酸纤维素膜作为固相载体，且细胞粘附因子的特异性抗体在4～20℃、30～35％的湿度条件下点样到固相载体上。附图说明图1是本专利技术的结构示意图。其中：硝酸纤维素膜-10，特异性抗体点样孔-11。具体实施方式结合以下实施例对本专利技术作进一步描述。一种检测病理性近视的筛查试剂盒，如图1所示，包括抗体芯片，细胞粘附因子标准品，生物素标记的细胞粘附因子检测抗体混合物；和荧光素Cy5标记的链霉亲和素；所述抗体芯片以含有失水山梨醇酯的亲水试剂处理的硝酸纤维素膜作为固相载体，且细胞粘附因子的特异性抗体在4～20℃、30～35％的湿度条件下点样到固相载体上。优选地，所述细胞粘附因子检测抗体混合物为层粘连蛋白受体(LN)的特异性抗体。优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.03～0.8％的失水山梨醇酯、0.05～0.8％的甘油和0.01～0.1％的聚乙二醇2000的去离子水溶液。优选地，所述亲水试剂处理硝酸纤维素膜的方法为：首先用去离子水清洗3次商品膜，每次3～5min；晾干后，将膜片浸泡在25℃的亲水试剂10-30min，4℃真空干燥备用。优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.05～0.5％的失水山梨醇酯、0.1～0.5％的甘油和0.01～0.5％的聚乙二醇2000的去离子水溶液。优选地，所述细胞粘附分子在4～15℃，30～35％的湿度条件下点样到固相载体上。优选地，所述点样的细胞粘附分子浓度为5～30ng/ml；优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.1％的失水山梨醇酯、0.2％的甘油和0.05％的聚乙二醇2000的去离子水溶液；所述细胞粘附分子在4℃，30％的湿度条件下点样到固相载体上。本专利技术通过含有失水山梨醇酯的亲水试剂处理的硝酸纤维素膜背景低，检测灵敏度高，并且所检测的细胞粘附因子灵敏度可达单因子的ELISA检测灵敏度。本专利技术的抗体芯片试剂盒克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。实验例芯片操作流程1.1、每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量抗体芯片。1.2、抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。注：不同样品的孵育量不一样：血浆、血清使用前用样品稀释液1：1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后加入5-50ug的量。1.3、清洗：抽去每个孔中的标准品或样品，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液I。抽去每个孔中的1×洗液I，加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液II。1.4检测抗体混合物的孵育：离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。1.5清洗：抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液。1.6Cy5-链霉亲和素的孵育：离心Cy5-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的Cy5-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。1.7清洗：抽去每个孔中的Cy5-链霉亲和素，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液。1.8荧光检测1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。2)将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液I，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液I，添加约30ml的1×洗液II，在室温摇床上震荡5min。3)去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。4)采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号，采用绿色通道(激发频率＝650nm)。1.9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析1)用GenePix软件来读取生物芯片的荧光值。2)读数后选用的数值为扣除点周围背景的中间值读数(F532Median-LocalBackground)。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本专利技术的技术方案，而非对本专利技术保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本专利技术作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的实质和范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测病理性近视的筛查试剂盒，其特征在于，包括抗体芯片，细胞粘附因子标准品，生物素标记的细胞粘附因子检测抗体混合物；和荧光素Cy5标记的链霉亲和素；所述抗体芯片以含有失水山梨醇酯的亲水试剂处理的硝酸纤维素膜作为固相载体，且细胞粘附因子的特异性抗体在4～20℃、30～35％的湿度条件下点样到固相载体上。

【技术特征摘要】
1.一种检测病理性近视的筛查试剂盒，其特征在于，包括抗体芯片，细胞粘附因子标准品，生物素标记的细胞粘附因子检测抗体混合物；和荧光素Cy5标记的链霉亲和素；所述抗体芯片以含有失水山梨醇酯的亲水试剂处理的硝酸纤维素膜作为固相载体，且细胞粘附因子的特异性抗体在4～20℃、30～35％的湿度条件下点样到固相载体上。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞粘附因子检测抗体混合物为层粘连蛋白受体(LN)的特异性抗体。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述亲水试剂为质量分数为0.03～0.8％的失水山梨醇酯、0.05～0.8％的甘油和0.01～0.1％的聚乙二醇2000的去离子水溶液。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述亲水试...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨林，
申请(专利权)人：深圳森阳环保材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44