人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白自身免疫抗体的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种自身免疫抗体的检测方法，其包含以下步骤：将待检测抗体的抗原蛋白的表达载体和伴侣蛋白表达载体共转染细胞，将转染的细胞固定后，洗涤后加入待测血清孵育，加入二抗孵育后分析；所述待检测抗体的抗原蛋白为MOG蛋白。这种检测方法具有检测效率高，特异性好，敏感性强的特点。成功解决了免疫印迹和酶联免疫吸附法中常见的检测结果假阳性或假阴性的问题，具有十分重要的研究和实用价值。

【技术实现步骤摘要】
人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白自身免疫抗体的检测方法
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及到人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白自身免疫抗体的检测方法。
技术介绍
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelinoligodendrocyteglycoprotein，MOG)是由少突胶质细胞特异产生存在于中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)髓鞘最外层含量极微的髓鞘蛋白成分，MOG的生理功能包括髓鞘的组成蛋白、细胞表面黏附分子介导髓鞘与胞外基质的相互作用、调节微管的稳定性和参与补体系统的激活等。国内外研究表明，在多种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病中，如多发性硬化(MS)、急性脊髓炎症(AM)以及视神经脊髓炎(NMO)等可检测到针对MOG的自身免疫抗体。且MOG抗体阳性的患者具有其独特的临床、影像学、治疗、预后转归特征。MOG抗体的检测对神经系统炎性脱髓鞘疾病的诊断、治疗和预后判断具有极其重要的指导意义。早期针对MOG自身免疫抗体的检测方法主要采用免疫印迹和酶联免疫吸附法，但国内外最新的研究表明，临床患者来源的MOG自身抗体需要特异性结合具有空间构象且糖基化修饰的MOG抗原，而早期采用的方法制备的MOG抗原不具备正确的空间构象或糖基化修饰，因此无法特异性结合患者来源的MOG自身抗体，特异性及敏感性均存在较为严重的问题。因此，专利技术一种具有高效检测MOG自身抗体的方法具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白自身免疫抗体的检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种自身免疫抗体的检测方法，其包含以下步骤：将待检测抗体的抗原蛋白的表达载体和伴侣蛋白表达载体共转染细胞，将转染的细胞固定后，洗涤后加入待测血清孵育，加入二抗孵育后分析。优选的，待检测抗体的抗原蛋白为MOG蛋白。进一步优选的，MOG表达载体是pEGFP-IRES-MOG。优选的，伴侣蛋白是calnexin蛋白。优选的，伴侣蛋白表达载体是pcDNA-calnexin。优选的，共转染细胞为HEK293T细胞。优选的，二抗为lexaFluor546标记的山羊抗人IgG。一种自身免疫抗体的检测方法在检测MOG自身免疫抗体中的应用。本专利技术的有益效果是：本检测方法具有检测效率高，特异性好，敏感性强的特点。成功解决了免疫印迹和酶联免疫吸附法中常见的检测结果假阳性或假阴性的问题，具有十分重要的研究和实用价值。附图说明图1为不同MOG表达载体的表达效果图，其中，expressionvector1为pcDNA3.1-MOG表达载体，expressionvector2为pEGFP-IRES-MOG表达载体。图2为同时表达MOG抗原的分子伴侣蛋白calnexin后，MOG抗原在细胞表面的表达水平。图3为不同细胞中MOG蛋白的表达效果图，其中cellline-1为HEK293细胞；cellline-2为CHO细胞，cellline-3为HEK293T细胞。具体实施方式实施例1表达载体的构建尝试多种MOG表达载体，包括pcDNA3.1-MOG,pcDNA3.1-MOG-GFP(表达MOG和GFP融合蛋白)，pEGFP-IRES-MOG等，通过筛选比较细胞表面表达的MOG抗原水平，表达载体pEGFP-IRES-MOG(expressionvector2)(图1)细胞表面表达的MOG抗原显著高于其它表达载体。pEGFP-IRES-MOG载体的构建方法是：在真核表达载体pEGFP载体(具有CMV启动子)的绿色荧光蛋白(GFP)基因下游插入内部核糖体进入位点序列(IRES)，并在IRES后克隆编码人全长MOG的cDNA序列获得。将人calnexin基因克隆到pcDNA3.1载体获得pcDNA-clanexin表达载体。2伴侣蛋白calnexin促进MOG抗原的膜表达采用转染细胞的间接免疫荧光法检测MOG自身免疫抗体，在活细胞表面表达MOG抗原的丰度是决定检测灵敏度的关键因素。我们首先通过共表达MOG抗原的分子伴侣蛋白calnexin,显著提升了MOG抗原在细胞表面的表达水平(图2),荧光定量结果表明共表达分子伴侣蛋白calnexin可使MOG抗原在细胞表面的表达水平提高3倍以上；3筛选优化转染细胞株采用GFP信号代表转染的细胞，应用针对MOG表明抗原的抗体检测细胞表面表达的MOG蛋白。结果表明在HEK293T细胞系中，细胞表面表达的MOG抗原要显著高于其它细胞系(cellline-1和cellline-2)(图3A)；应用免疫印迹检测上述细胞系中转染表达的MOG抗原总蛋白，结果表明在HEK293T细胞系中，细胞表达的总MOG抗原要显著高于其它细胞系(cellline-1和cellline-2)(图3B)；免疫印迹定量分析表明，在HEK293T细胞系中，细胞表达的总MOG抗原相对于其它细胞系(cellline-1和cellline-2)分别有20倍及4倍以上的提高(图3C)。4检测专利技术人分析了中山大学附属第三医院神经内科疑似脱髓鞘类疾病患者样本816例，检测结果MOG抗体阳性78例，在正常对照组200例样本中，未检测到任何阳性结果。充分证明了本检测方法的特异性。我们随机选取其中30例阳性样本血清，分别送往天津人民总医院神经内科检验中心，欧蒙检验中心及本中心(重复检测)进行多中心比较。采取的检测方法是：将表达载体pEGFP-IRES-MOG和pcDNA-calnexin应用脂质体共转染培养在24-孔板中人胚肾293T(HEK293T)细胞(每孔DNA量0.8μg)，转染30h后，转染的HEK293T细胞用4％的甲醛溶液固定10min，PBS洗涤后加入经PBS稀释后的患者血清(1：50，总体积300μl)在室温条件下孵育30min，PBS洗涤三次后，加入用AlexaFluor546标记的山羊抗人IgG的二抗(1：800稀释于PBS，总体积200μL)，室温条件下孵育30min，PBS洗涤三次后通过荧光显微镜分析。结果如下：30例阳性样本血清用本专利技术方法可完全重复验证，天津人民总医院神经内科检验中心可检验获得16例阳性(基于细胞抗原间接免疫法)，而欧蒙检验中心仅获得6例阳性结果(基于细胞抗原间接免疫法)。基于本专利技术正常对照组研究结果和检测中为未转染的细胞的同步对照，可完全排除假阳性结果。因此本专利技术在保证检测高度特异性的前提下，在多中心的比较中，灵敏度获得相当大的提高。同时应用本专利技术方法，专利技术人进一步分析了上述两个中心的MOG阳性样本，均可重复阳性鉴定结果，进一步支持了本专利技术检测的高灵敏度。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自身免疫抗体的检测方法，其包含以下步骤：将待检测抗体的抗原蛋白的表达载体和伴侣蛋白表达载体共转染细胞，将转染的细胞固定后，洗涤后加入待测血清孵育，加入二抗孵育后分析。

【技术特征摘要】
1.一种自身免疫抗体的检测方法，其包含以下步骤：将待检测抗体的抗原蛋白的表达载体和伴侣蛋白表达载体共转染细胞，将转染的细胞固定后，洗涤后加入待测血清孵育，加入二抗孵育后分析。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待检测抗体的抗原蛋白为MOG蛋白。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述MOG表达载体是pEGFP-IRES-MOG。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭立胜，邱伟，王施思，陆正齐，
申请(专利权)人：广州基迪奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44